rpkm计算法

A. 基因中map和read是什么意思

此处，map的意思是“比对到基因图上”；read是指测序出的一条序列，也称“读序”。

正在做RNA seq?

RPKM, Reads Per Kb per Million reads
RPKM=（10的9次方×C）/（N×L）。RPKM为某基因的表达量，C为唯一比对到该基因的reads数，N为唯一比对到参考基因的总reads数，L为该基因编码区的碱基数。RPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因表达差异。

B. 如何根据RPKM值求差异表达基因

差异表达基因分析是根据表型协变量（分类变量）鉴定组间差异表达，它属于监督性分类的一种。在鉴定差异表达基因以前，一般需要对表达值实施非特异性过滤（在机器学习框架下属于非监督性分类），因为适当的非特异性过滤可以提高差异表达基因的检出率、甚至是功效。R分析差异表达基因的library有很多，但目前运用最广泛的Bioconctor包是limma。

鉴定差异表达基因是表达谱芯片分析pipeline中必须的分析步骤。差异表达基因分析是根据表型协变量（分类变量）鉴定组间差异表达，它属于监督性分类的一种。在鉴定差异表达基因以前，一般需要对表达值实施非特异性过滤（在机器学习框架下属于非监督性分类），因为适当的非特异性过滤可以提高差异表达基因的检出率、甚至是功效。R分析差异表达基因的library有很多，但目前运用最广泛的Bioconctor包是limma。

C. 拼接转录本cluster怎么确定差异基因

FoldChange，就是两样品中同一个基因表达水平的变化倍数。
可以用RPKM、FPKM或TPM值来计算。实验组和正常组的表达值的差异倍数，是用于检测差异表达基因的最基本的方法，由于其简单，易理解和不错的实验结果，使得其成为差异表达直观分析的首要选择。
FoldChange方法在探测差异表达基因时，能够直接的得到差异变化值，因此在与差异表达绝对值相关的研究时具有优势。

D. 为什么rpkm是fpkm的两倍

R是reads，F是fragments，因而对于单端测序来说，二者相同；对于双端测序，FPKM将两端的reads当作一个fragment，只计算比对到同一转录本的数量，所以有RPKM是FPKM两倍的情况

E. 如何计算cuffdiff中的FPKM值

FPKM与RPKM计算方法基本一致。公式如下：

(5)rpkm计算法扩展阅读：

FPKM计算的是片段（fragments），而RPKM计算的是数据（reads）。Fragment比read的含义更广，因此FPKM包含的意义也更广，可以是pair-end的一个fragment，也可以是一个read。

比如对应到该基因的read有1000个，总reads个数有100万，而该基因的外显子总长为5kb，那么它的FPKM为：

10^9*1000(reads个数)/10^6(总reads个数)*5000(外显子长度)=200

或者：1000(reads个数)/1(百万)*5(K)=200这个值反映基因的表达水平。

F. geo数据库数据如何标准化

标准化的方法就是Counts值：

对给定的基因组参考区域，计算比对上的read数，又称为raw count（RC）。

aw count作为原始的read计数矩阵是一个绝对值，而绝对值的特点是基因长度、测序深度不同不可以比较。所以我们要进行标准化把count矩阵转变为相对值，去除基因长度、测序深度的影响，我们采用分析的。

标准化的三种方法得出的三种值：

RPM (Reads per million mapped reads)：RPM方法：10^6标准化了测序深度的影响，但没有考虑转录本的长度的影响。

RPKM/FPKM方法：

103标准化了基因长度的影响，106标准化了测序深度的影响。TCGA的数据分析多采用这种结果。

TPM (Transcript per million)：TPM的计算方法也同RPKM/FPKM类似，TPM可以看作是RPKM/FPKM值的百分比。

具体判断方法：

表达量是否需要重新标准化。

可以通过boxplot函数观察一下样本表达丰度值的分布是否整齐进行判断。

是否需要log2:根据数据值的大小。

如果表达丰度的数值在50以内，通常是经过log2转化的。如果数字在几百几千，则是未经转化的。

G. 差异基因分析pvalue，fdr是怎么计算的

在利用RNA-seq数据比较分析两个样品中同一个基因是否存在差异表达的时候，一般选取两个标准：
i）FoldChange
FoldChange，很容易理解了。就是两样品中同一个基因表达水平的变化倍数。可以用RPKM值来计算，关于RPKM的计算方法，请参考<RPKM的简介>
ii）FDR校正后的p-value，即q-value
FDR值的计算方法如下：
1）对每个基因进行p-value的计算
假设观测到基因A对应的reads数为x，已知在一个大文库中，每个基因的表达量只占所有基因表达量的一小部分，在这种情况下，p(x)的分布服从泊松分布。已知样本一中唯一比对到基因组的总reads数为N1，样本二中唯一比对到基因组的总reads数为N2，样本一中唯一比对到基因A的总reads数为x，样本二中唯一比对到基因A的总reads数为y，则基因A在两样本中表达量相等的概率可由以下公式计算：

H. fpkm能代表表达量吗

fpkm不能代表表达量。fpkm是衡量基因相对表达量一个公式。

FPKM是将Map到基因的Fragments数除以Map到Genome的所有Read数(以Million为单位)与RNA的长度(以KB为单位)。适用于单端和双端测序。

FPKM和RPKM的区别：

不同点就是FPKM计算的是片段（fragments），而RPKM计算的是数据（reads）。

Fragment比read的含义更广，因此FPKM包含的意义也更广，可以是pair-end的一个fragment，也可以是一个read。

FPKM和RPKM RPKM代表每千个碱基的转录每百万映射读取读数。 FPKM代表每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片。

I. 一个基因序号中3T_FPKM是什么意思

颜色代表了基因在样品中的表达量水平（log2FPKM+1）。Cuffdiff采用FPKM[16]（）作为衡量转录本或基因表达水平的指标，FPKM计算公式如下：