尿蛋白pcr算法

Ⅰ 南京军区总医院目前的肾科权威专家主要有哪些其专业特长和专家门诊时间是什么

黎磊石，必须的。

Ⅱ 电泳技术在生物分离工程中的地位

早期的电泳技术是由瑞典Uppsala大学物理化学系Svedberg教授提出了荷电的胶体颗粒在电场中移动的现象称其为电泳。于1937年，收ArneTiselius教授——诺贝尔奖金获得者，利用些电泳现象，发明了最早期的界面电泳，用于蛋白质分离的研究，开创了电沪泳技术的新纪元。此后，各种电泳技术及仪器相继问世，先进的电泳仪和电泳技术的不断发展，使它在生物化学实验技术中占重要地位，按电泳的原理有三种形式的电泳分离系统：原则上按电泳的原理来分，即移动界面电泳、区带电泳和稳态电泳或称置换（排代）电泳。在自由移动界面电泳，是带电分子的移动速率通过观察界面的移动来测定，该方法已成为历史。代之以采用支持介质的区带电泳。

区带电泳因所用支持体的种类、粒度大小和电泳方式等不同，其临床应用的价值也各有差异。固体支持介质可分为两类：一类是滤纸、醋酸纤维素薄膜、硅胶、矾土、纤维素等；另一类是淀粉、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。由于它们具微细的多孔网状结构，故除能产生电泳作用外，还有分子筛效应，小分子会比大分子跑得快而使分辨率提高。它的最大优点是几乎不吸附蛋白质，因此电泳无拖尾的现象。低浓度的琼脂糖电泳相当于自由界面电泳，蛋白质在电场中可自由穿透，阴力小，分离清晰，透明度高，能透过200～7000nm波长的着色区带的检测敏感性，为此第一类支持介质现已被第二类支持介质所替代。

稳太电泳或称置换电泳的特点是分子颗粒的电泳迁移在一定时间后达到稳态，如等电聚焦和等速电泳。

区带电泳是临床检验领域中应用最广泛的技术，有重要临床意义，尤其是其他新技术，更扩大了其应用范围，提高了检测技术，现对该技术的现状与发展作一评述。

一、正确解释电泳结果，有助于临床疾病判断的参考

新鲜血清经电泳后可精确地描绘出患者蛋白质的全貌，一般常见的是白蛋白降低、某个球蛋白区域升高，提示不同的临床意义。如急性炎症时，可见a1，a2区百分率升高；肾病综合征、慢性肾小球肾炎时呈现白蛋白下降，a2球蛋白升高，β球蛋白也升高；缺铁性贫血时可由于转铁蛋白的升高而呈现β区带增高，医|学教育网搜集整理而慢性肝病或肝硬变呈现白蛋白显着降低，r球蛋白升高2-3倍，示免疫球蛋白多克隆增高，甚至可见β-r融合的桥连现象，还可在r区呈现细而密的寡克隆区带；对单一克隆浆细胞异常增殖所产生的无抗体活性均一的免疫球蛋白称M蛋白的检测，血清蛋白电泳是其首选的实验诊断方法。可在电泳区带的a2-r区呈现致密而深染，高度集中的蛋白克隆增生区带，称其为m蛋白区带，扫描后形成高而狭窄的单株峰，若些峰在r区其峰高与峰底宽之比>2：1，而由于正常免疫球蛋白合成限制造成背景染色浅。由M蛋白所导致的一组疾病如：多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病、游离轻链病、半分子病、良性单株丙球血症和双M蛋白血症等，目前这类疾病已不属罕见。血清蛋白电泳对这类疾病的早期诊断，疗效观察和预后判断均有十分重要的意义。

二、电泳技术与免疫技术相结合，大大扩大了其临床应用的范围

让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运行方向、从而加快了沉淀反应速度。免疫电泳技术的种子类很多，如：对流免疫电泳（CIEP）、火箭免疫电泳（RIE）、电免疫扩散（EID）。在种免疫电泳方法牟基础上，又不断地派生出一些新的技术，如：免疫电泳（IEP）技术，1969年Alper与Johnson推荐免疫固定电泳（IFE）是一种包括琼脂糖凝胶蛋白电泳和免疫沉淀两个过程的操作，是免疫沉淀反应的一种混合技术，检测标本可以是血清、尿、脑脊液或其他体液。1976年血清免疫固定电泳（IF）技术再次被推荐，用于M蛋白的分型。血清蛋白质在琼脂糖凝介质上经电泳分离后，应用固定剂和各型免疫球蛋白及轻链抗血清，加于凝胶表面的泳道上，经孵育让固定剂和抗血清的在凝胶内渗透并扩散后，若有对应的原存在，则在适当位置形成抗原抗体复合物。经染色后蛋白质电泳参考泳道和抗原抗体沉淀区带被氨基黑着色，根据电泳移动距离分离出单克隆组分，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。该技术的最大优势是敏感性达50-150mg/dl，操作周期短，仅需数小时，分辨率高，结果易于分析。现最常用于M蛋白的分型与鉴定，已列入临床实验室的常规检测工作。

三、电泳技术进行同工酶谱分析，提高诊断率

1、血清乳酸脱氢酶同工酶（iso-LDH）：测定LDH同工酶有电泳法、离子交换柱层析法、免疫法、抑制剂法和酶切法，但迄今用得取多的仍是琼脂糖凝胶电泳法。经电泳分离后要分离出五种同工酶区带，急性必肌梗塞发病后平均6hLDH1即开始升高，LDH1/LDH2≥1为心肌损伤的阳性决定性水平，肝癌时可见LDH5明显升高，各区带含量的确定，将经电泳分离后的同工酶谱采用扫描予以定量，其精确度明显高于用肉眼判断。

2、血清肌酸激酶同工酶（ISO-CK）；测定CK和CH-MB仍是目前用于证实急性心肌梗塞的道选指标。近年来国内一些单位用免疫抑制法测CK=MB，其原理为抗M亚单位的酶活性，因为正常血清中几乎无CK=BB，故将此值乘以2可以认为大致代表CK-MB的活性。此法简单迅速，缺点是特异性差，如患者血清中存在CK-BB或者异常CK时，都将出现假性增高。不少作者报道异常CD-同工酶，一条称巨CK（Maxro-CK），它是CK-BB与免疫球蛋白的复合物，有IgG亦有IgA，在正常血清中Marco-CK仅占0.8%-1.6%.另一条称线粒体CK（CK-MT），CK-MT是结合在肌肉、脑、肝内的线粒体表面，可能是线粒体膜的碎片，在正常血清中CK-MT是不出现的，在心梗时亦不出现，只有当组织极度损伤，由于线粒体和细胞壁极度破坏，方可在血清中检出。由于Macro-CK和不典型的CK-MT均不能被M抗体所抑制，故当它们出现时，会导致CK-MB高于CK总活力的假性升高。使用电泳方法分离CK-MB，是根据CK-同工酶分子结构不同，医|学教育网搜集整理在电泳缓冲液中，所带电荷各异，可以从阴极到阳极将CK不同组份予以分离，其分别为CK-MM，CK-MB和CK-BB.电泳特点是当出现异常2同工酶如巨CKⅠ、巨CKⅡ等，从电泳图谱上很容易发现，由扫描仪对各条酶进行扫描，报告各条区带所占百分比，结合总酶活力，求得区带的酶省略定值结果。Macro-CK在CK-MM和CK-MB中间，而CK-MT位置靠近阴极端，在CK-MM后面。这样不会将CK-BB和各种异常同工酶误认为是CK-MB而误诊，也可解决CK-MB假性增高的错误原因所在。为此，CK同工酶电泳是项非常实用的检验技术，具有十分重要的临床意义。

3、CK亚型同工酶：此外，CK-MB和CK-MM亚型测定常采用琼脂糖凝胶等电聚焦电泳或高压电泳，由于操作比一般电泳麻烦，故常规常测定尚无法普及。目前引进的自动电泳仪，有试剂盒提供，可作CK亚型分析，参考值：CK-MM1（57.7±4.7）%；CK-MM2为（26.5±5.3）；CK-MM3为（15.8±2.5）%；CK-MM3/CK-MM1比值为0.28±0.05（范围0.15-0.39），阳性决定性水平>0.5.AMI第一天血中以MM3为主，但第二天以后则以MM1为主。采用电泳法分离CKMB，CKMB1和CKMB2在正常人血中CK-MB2极微，一般比值近似是而非，在急性心肌梗塞后4-6hCKMB2亚型即在血循环中可被检测到，故MB2/MB1的比例明显升高，并早于总CK-MB片段的增高。当心肌梗塞缓解后此比便也逐渐下降。也可用于溶栓治疗后的病情观察。

四、结合酶免疫标记抗体技术，检测脑脊液内寡克隆区带

曾有作者报道采用二维电泳和银染进行CSF蛋白质的分离与鉴定，方法繁复，耗时，现采用高分辨率琼脂糖凝胶电泳分离CSF中的蛋白质，并经抗原和辣根过氧化物酶标记的特异性IgG抗体进行反应来鉴定“寡克隆区带”（OCB），经此酶免疫标记放大技术和显色步骤，蛋白质浓度达31-125ul/L即可予以检测，可使检测灵敏度提高了100倍，这样脑脊液无须浓缩，避免了在浓缩过程中蛋白质的丢失。可用于证实和分辨OCB免疫球蛋白及其型别。若在脑脊液标本中检出OCB，而其相应标本中未能检出区带，则为阳性，真实地反映是由中枢神经系统本身合成的免疫球蛋白，具有重要临床意义。它是一种定性检测，在多发性硬化症时，OCB是一个十分重要的标志物。但须将患者血清和CSF在同一天同步进行分析，以认证不同来源的免疫球蛋白。中枢合成免疫球蛋白是中枢神经系统疾患的一个重要信号，主要用于诊断的鉴别诊断中枢神经系统疾患如：多发性硬化症、痴呆、脊髓炎、付肿瘤性脑炎、神经性梅素等。

五、利用固相内抗原、抗体反应分离脂蛋白（a），用于心、脑知管独立的危险因子的检测

该技术是利用抗原、抗体反应将电泳分离的脂蛋白予以鉴别。血清经琼脂糖凝胶电泳，再经染色后可出现不同脂蛋白的条带。由于凝胶中脂蛋白等电点不同，不仅可区分a、前β和β区带，又因介质中含有抗脂蛋白（a）【LP（a）】抗体及阳离子存在，抗LP（a）与患者血清中LP（a）结合形成复合物，阳离子则抑制其他脂蛋白的泳动速度，LP（a）便与其他脂蛋白分离开来，使分辨十分清晰的LP（a）条带呈现在前β与γ区域之间，将阳性条带扫描后，可获得区带的面积及其百分含量，该方法使电泳技术趋于完美，大大减少了手工操作的弊端，既可予以半定量，又能将胶片保存，便于比较。提高对心、脑血管独立的危险因子——LP（a）检测的敏感性和特异性。

六、按分子量大小进行非浓缩尿蛋白电泳，区分尿蛋白类型

尿蛋白电泳可将尿液中各种蛋白质分离用于区分尿蛋白类型，可在无操作的情况下，协助临床判断肾脏损伤的部位。国内部分实验室采用SDS-PAGE盘状电泳进行尿蛋白分离，该法具有局限性，耗时，操作繁琐，标本要求高，尿液需预浓缩，不适于临床实验室广泛开展。SDS=AGE电泳不需预浓缩，尿蛋白电泳后呈现出中、高分子量蛋白区，带主要反应肾小球病变；呈现出低分子量蛋白区带，可见于肾小管病变及溢出性蛋白尿；混合性蛋白尿则可见到大、中、小各种分子量区带，示肾小球及肾小管均受累及。扫描仪可对电泳后尿液中蛋白质剖象进行扫描，求出百分比，以显示肾小球或肾小管损伤程度，其电泳图谱及扫描图形可作国资料永载，利于分析比较。医|学教育网搜集整理该技术的最大进步是尿液不需预浓缩，操作简便，结果清晰，仅需三小时即可完成试验，还备有完整的定性标准，易于量化，便于分析，对肾脏疾的诊断，鉴别诊断，指导治疗和判断愈合颇有价值。

近期发展起来的毛细管电泳是一种新型的区带电泳，又称毛细管带电泳。它是在毛细管中装入缓冲液，在其一端注入样品，在毛细管两端加直流高电压实现对样品的分离，他离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。毛细管电泳在检验医学中的应用也十分广泛，从所检测样品的来源看可分为尿样、血浆、血清、脑脊液、红细胞、其他体液或组织，以及实验动物活体等。从分离对象看包括蛋白质、多肽、氨基酸、糖、酶、DNA、寡核苷酸、病毒、小和生物活性分子、离子、药物及其代谢产物等。根据用途可分为临床疾病诊断、临床蛋白质分析、临床药物分析、代谢研究、病理研究、同工酶分析、PCR产物分析、DNA片段及序列分析等。由于它具有无法比拟的高效和快速性，因而受到越来越多科学家们的重视。

中国的电泳技术起步不算太晚，但由于种种原因，大多数实验室仍采用较落后的电泳设备。随着国际、国内科技发展的日新月异和检验医学发展的突飞猛进，电泳技术也在不断发展和更新，其在临床医学和分子生物学领域中有着极其广泛的应用价值，相信随着该技术的不断发展必将越来越受到同道们的青睐。

Ⅲ 如何治疗糖尿病

糖尿病是一种慢性病,它是由于身体中胰岛素分泌不足或胰腺功能完全丧失以及不能适当地利用胰岛素所致。它的特征表现为血液中葡萄糖的浓度异常升高及尿中有尿糖。 预防 良好的生活方式对于糖尿病的预防非常关键,应该注意以下4 个要点: 1. 了解糖尿病的知识,从而了解更多的防治措施。 2. 要少吃一点,就是让摄取的总热量少一点,不但主食要少吃,而且副食,特别是高热量的副食也要少吃。 3. 要经常保持一定的运动量。这样控制了饮食,再加上增强了锻炼,体重就不至于过胖。4. 心理调节。一个好的心态对糖尿病的预防也是有其积极作用的。因为吃得多、锻炼少容易引起血糖升高,各种心理不平衡会进一步加强胰岛素抵抗,促使糖尿病的发生。 症状 糖尿病的典型症状为“多尿、多饮、多食和消瘦”,简称“三多一少”。其含义为:排尿次数和尿量增加,常有口渴、口干而饮水量增加,有饥饿感而饭量明显增加,与之伴随的是体重的明显减轻。但是,有50 %以上的Ⅱ型糖尿病患者患病初期无任何明显的症状。此外,糖尿病还有一些不典型症状需要给予注意,如:乏力、反复感染、伤口不易愈合、皮肤瘙痒、四肢皮肤感觉异常、视力下降、性功能障碍等。 诊断标准及分型 空腹尿糖阳性是诊断的重要线索,空腹血糖≥7. 0mmol/ L ,餐后2 小时血糖或随机血糖≥11. 1mmol/ L 可诊断为糖尿病,再结合临床症状作出最终诊断。 有三种基本的糖尿病类型,它们分别为Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、妊娠期糖尿病。Ⅰ型糖尿病:病人体内只能产生少量或者不能产生胰岛素。本型可以发生于任何年龄,且在儿童和青年人中更多发生。在中国糖尿病人中,此型仅占一小部分。这类糖尿病患者必须用胰岛素治疗,又称胰岛素依赖型糖尿病。 Ⅱ型糖尿病约占我国糖尿病患者的95 %。又称为成年发病型糖尿病。此型糖尿病患者均不能分泌足量的胰岛素以供身体之需,或者是产生的胰岛素不能有效发挥作用,从而导致了血糖的升高,久而久之,还会出现一系列并发症,如眼睛、肾脏、心脏和大血管病变等。 妊娠期糖尿病是指妇女妊娠怀孕期间患上糖尿病。临床数据显示大约有2 % - 3 %的女性在怀孕期间可发生糖尿病,有近35 %妊娠期发生糖尿病的妇女可能发展成为Ⅱ型糖尿病。 治疗及用药 一、非药物疗法饮食控制是治疗糖尿病的基础,可以根据标准体重计算每日所需热量,再计算出每日应摄入的碳水化合物、蛋白质和脂肪的比例。饮食中可加入大量纤维素。1. 平衡膳食,以达到足够的营养。 2. 避免高糖食物,如各种糖果、甜食。 3. 减少脂肪的摄入,除限制动物脂肪外,每日食用烹调油在20 克以下。 4. 避免油腻和含脂肪高的食物,如油炸食品及瓜子、花生等。 5. 避免含胆固醇高的食品,如动物内脏。 6. 选择高纤维食物,如粗粮、含纤维高的蔬菜。 7. 定时定量进餐,可以少量多餐。 8. 保证蛋白质的摄入,每公斤体重摄入蛋白质1. 2 克,但不要过多。 9. 多饮水。 10. 在血糖控制好的情况下,可以在两餐中间吃少量水果,并且减少相应主食摄入量。运动控制糖尿病至关重要,可以尝试以下几点: 1. 勤做操。科学家指出,即使断断续续做做保健操也能控制糖尿病的发展。要正确选择做操的时间:饭后2 个小时,血液里糖分增加,这时做操有助于血液里糖分保持平衡。 2. 慢步小跑对心脏和血管有利。所以,每天半小时快步走或慢跑步,能同时防治两种疾病:心肌硬死和糖尿病。 3. 减去多余的重量。减肥有助控制糖尿病。减肥3 公斤就能大大降低血液里糖的含量。 二、药物疗法 西药非处方药 Ⅰ型糖尿病者应当使用胰岛素注射液,胰岛素分短效及长效三种,根据病情在医生指导下使用。 Ⅱ型糖尿病患者必须长期服用降糖药物,常用的有两大类,即磺酰脲类(甲苯磺丁脲、优降糖、美吡达、达美康、糖适平) 与双胍类(降糖片、降糖灵) 。 中成药 糖尿病患者可以根据中医辨证选用中成药辅助治疗。 常使用的药品有参芪降糖片、金芪降糖片、益津降糖口服液、降糖丸、消渴丸等。还有卓奇诺胶囊可以清热、除湿、滋阴等作用,适用于消渴症。另外露水草胶囊也具有滋阴清热。 三、用药须知 1. 药物治疗取决于病型、病情、年龄及肝肾功能,尚无固定的治疗模式。患者必须在医院确诊后在医师指导下,对症使用各类药物。 2. Ⅰ型糖尿病在饮食控制和运动疗法的基础上可用胰岛素终身治疗; Ⅱ型糖尿病在非药物治疗不能控制血糖时应开始药物治疗。 3. Ⅱ型糖尿病大多服用降糖药,先选一种,调整适合剂量,疗效不满意时可加用双胍类或磺脲类和胰岛素,可能将空腹及餐后血糖、糖化血红蛋白(HbA1c) 控制在接近正常范围内,以延缓糖尿病并发症的发生和进展。

Ⅳ 尿pcr是什么意思

尿总蛋白与肌酐比值

Ⅳ 出现蛋白尿，除了是肾脏病，还有可能是什么

▲肾单位的解剖结构

02

看看你属于哪种蛋白尿类型？

总体而言大概可分为三类：

一过性蛋白尿

直立性蛋白尿

持续性蛋白尿

一过性蛋白尿：会短暂性间歇出现，是目前最常见的蛋白尿类型，可出现在发热感染或剧烈运动之后，通常不需要治疗。前面说的小伙子，就是这个类型，跟他说清楚之后，心里的大石头就落了下来。

直立性蛋白尿：特点是直立位时尿蛋白排泄增加，而平躺卧位时没有蛋白尿，多见于青少年，一般＞30岁的成年人不常见。直立性蛋白尿对身体基本上没有什么害处，一般也不需要治疗，另外蛋白尿的情况，通常随着年龄的增长而消失。

持续性蛋白尿：与一过性和直立性蛋白尿相比，具有潜在肾脏疾病风险。需要重点排查：肾脏疾病、糖尿病、高血压、狼疮等继发性疾病。

03

蛋白尿引起什么症状？

少量蛋白尿者一般没啥感觉和表现。然而，如果大量的蛋白尿，会出现水肿。水肿的特点：早上起床后发现面部，特别是眼皮水肿，下午出现双下肢的水肿，严重的会全身水肿。

还有就是不得不提的“泡沫尿”，这里必须说明的是正常的尿液，尿到马桶里也会出现一定量的泡沫，不一定就是蛋白尿，而真正的蛋白尿泡沫细小，不容易消散，尿上去的感觉像棉花糖，有种软绵绵的感觉。如果你还是区分不了，也不用纠结，请看下文如何诊断。

04

蛋白尿的诊断

蛋白尿通常行尿常规检查就可以明确，具体是提示蛋白几个加号，如果不放心，建议非同一天多测几次小便，看看自己到底有没有蛋白尿。

毕竟尿常规的蛋白是一种定性，如果两个或两个以上加号，建议做24小时尿蛋白定量，看看蛋白尿一天到底有多少。不方便的时候也可以测随机尿，做一个尿PCR（尿蛋白/尿肌酐）。

如果持续性蛋白尿诊断明确，医生肯能会让你继续抽血化验肝肾功能等指标，重点关注白蛋白及尿素氮和肌酐，明确有没有低蛋白血症和肾功能不全。大量蛋白尿，有时候医生会建议行肾穿刺活检术，而明确肾脏病变的类型以指导治疗。

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蛋白尿的治疗

一过性和直立性蛋白尿一般不会引起长期的健康问题，通常不需要治疗。

持续性低蛋白尿，医生一般会使用降压药物，如血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）或血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)，以减少或消除蛋白尿,或者具体根据肾穿刺病理类型，选用激素及免疫抑制剂来治疗。

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Ⅵ pcr的关键性技术

一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。

克隆PCR产物
1)克隆PCR产物的最优条件是什么？
最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。

2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？
如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。

3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？
A）涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。
例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。
铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：
1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞
如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。

4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。
B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。
D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。
E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞

PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul

PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显着的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
1.PCR反应的最适条件
4．1 TaqDNA聚合酶
在早期进行的PCR反应中，使用的是大肠杆菌DNA聚合酶1的大片段，，即Klenow片段。也曾有人用噬菌体T4 DNA聚合酶。这两种酶的共同弱点是对热不稳定性，DNA合成反应只能在370C进行。PCR时每一循环的解链温度都在90C以上进行，故在每两个循环之间要加入新的DNA聚合酶，使得整过程整个实验过程很繁琐和昂贵。同时在370C，引物与DNA模板之间会发生分子非特异性结合，最终导致很多非特异性DNA片段的扩增。
Taq 酶有耐高温的特性，其最适的活性温度是720C（75-80），连续保温30分钟仍具有相当的活性，而且在比较宽的温度范围内都保持着催化DNA合成的能力，一次加酶即可满足PCR操作过程自动化的实现。
（1） TaqDNA聚合酶的热稳定性及最适延伸温度
相对分子质量为94000的TaqDNA聚合酶的酶活性较高，大约为200000Umg，在合成时有一个较高的最适温度75-80C，转换数Kcat接近150nt/(s•酶分子)。这种活性有明显的温度依赖性。TaqDNA聚合酶虽然在90C以上合成DNA的能力有限，但高温时仍比较稳定。有人试验证明在92.5C,95C,和97.5C时，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分别经130分钟、40分钟和5-6分钟后仍可保持50%左右的活性，其半衰期较长。所以，在一个PCR预备试验中，每次循环时上限温度为95C（试管内）处理20秒，则循环50次后TaqDNA聚合酶仍可保持65%的活性，能够保证实验的需要。
TaqDNA聚合酶具有很高的加工合成特性，其最适延伸温度在75-80C时，dNTP的掺入速度为35-100nt/(•酶分子),最长延伸长度7。6kb，如对M13上的富含GC的30-me引物，该酶在70C的延伸率高于60nt/(•酶分子), 在55C仍有较高的延伸活性，22C和37C时延伸速度分别为0。25和1。5 nt/(•酶分子)。由此可见，在低温下，TaqDNA聚合酶一表现活性明显降低，因而，导致此酶在模板链分子内局部二级结构区域的延伸能力受损或前进速率常数与解离常数的比值发生改变。在很高的温度（90C以上）时，很少DNA合成。在体外条件下，DNA在较高温度时的合成速度受到引物或引物链与模板链的双链结构稳定性的限制。温度对TaqDNA聚合酶活性的影响见表。
由于TaqDNA聚合酶的最适延伸温度高达75-80C，故退火和延伸反应温度均可提高，限制了非特异性扩增产物的出现，增加了PCR的特异性。

4．2 模板
（1） 模板的纯度 一般不要求很高，不需要达到超纯。某些扩增实验中甚至可以直接将溶细胞液煮沸加热，用蛋白质变性后的DNA溶液作模板。但DNA溶液中不能有影响扩增反应的物质存在，例如蛋白酶、核酸酶、结合DNA的蛋白质等；另一类是尿素、十二烷基硫酸钠、卟啉类物质等；还有一类是二价金属离子的络合剂（如EDTA）等，会与Mg2+络合，影响Taq DNA聚合酶的活性。上述物质的存在会影响扩增效果，甚至使扩增失败。
（2） 模板DNA的量 一般对于单拷贝的哺乳动物基因组模板来说，100ul的反应体系中有100ng的模板已足够。有时，加的模板太多，会令扩增失败。这时如果对模板稀释后再加入反应体系中，往往能获得成功。
4．3 dNTP
dNTP储备液必须为PH7.0左右,浓度一般为2mmol/L, 分装后置-20C保存.典型的PCR扩增体系中,两种dNTP的终浓度为20-200umol/L. 理论上,100ul反应液中两种dNTP的浓度为20umol/L时,足以合成12.5ug DNA或合成10pmol 400bp的DNA片段. DNTP会络合溶液中的 Mg2+, 而且大于200umol/L的dNTP会增加Taq DNA聚合酶的错配率.如果dNTP的浓度达到1mmol/L时,则会抑制Taq DNA聚合酶活性.
4．4 Mg2+浓度
Taq DNA聚合酶在合成新DNA链时,要求有游离的Mg2+,因而在PCR系统中确定Mg2+的最适浓度是必要的. Mg2+浓度太低会无PCR产物,太高又会导致非特异的产物产生. 故常需根据各自的实验预先试验,以确定本实验的最佳Mg2+浓度,保证DNA聚合酶具有良好的活性.
通常情况下,要求反应体系中有0.5-2.5mmol/L的游离Mg2+.反应内容物中, dNTP能与Mg2+.结合,所含EDTA会与Mg2+络合,高浓度的DNA也有干扰作用,都会影响Mg2+的有效浓度.
4．5 PCR系统中的其它成分
PCR反应缓冲溶液通常用10 mmol/L Tris-HCl(PH8.3, 20C), 它是两性离子缓冲剂.此外,还有50 mmol/L KCL, 它有利于引物与模板退火.高于50mmol/L 的KCL, 或50mmol/L 的NaCl对Taq DNA聚合酶有抵制作用.明胶或血清白蛋白(100ug/ml)及非离子去污剂,如Tween20等,对Taq DNA聚合酶起稳定作用.
4．6 PCR的热循环计划
在标准反应中,将标本加热至90-95C,使DNA双链变性, 再快速冷却至40-60C使引物退火并结合到互补靶序列上,然后升温至70-75C, 在Taq DNA聚合酶的作用下掺入单核苷酸使引物沿模板延伸.每步时间从反应达到要求温度后计算. PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性引物退火和反应延伸3个步骤组成的.图中设定的反应参数是94C变性1分钟,60C退火1分钟,72C延伸1.5分钟.如此周而复始,重复进行,直到扩增产物的数量满足实验需求为止.
(1) 变性温度与时间 使靶基因模板和PCR产物完全变性是PCR成败的关键.DNA在其链分解温度时的变性只需几秒钟,但反应管内达到Tss还需一定时间,变性温度太高会影响酶活性;通常情况下94-95C变性1分钟就足以使模板DNA完全变性,更高的温度可能更为有效(尤其是富含C+G的靶基因),若低于94C,则需延长变性时间.为提高起始模板的变性效果,保存酶活性,常常在加入Taq 酶之前97C先变性7-10分钟,再按94C的变性温度进入循环方式,这对PCR的成功有益处.
(2) 复性温度与时间 复性温度决定着PCR的特异性.引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。合适的复性温度应低于扩增引物在PCR条件下真实Tm值的5C，引物越短（12-15bp）,复性温度越低（40-45C）。一般来说，若降低复性温度（37C），可提高坟增产量，但引物与模板间错配现象会增多，导致非特异性扩增上升；若提高复性温度（56-70C），虽扩增反应的特异性增加，但扩增效果下降。理想的方法是：设置一系列对照反应，以确定扩增反应的最适复性温度。
（3）延伸温度与时间 Taq DNA聚合酶虽能在较宽的温度范围内催化DNA的合成，但不合适的温度仍可对扩增产物的特异性、产量造成影响。引物延伸温度一般为72C（较复性温度高10C左右），延伸时间视目标DNA片段长短和浓度而定。在最适温度下，核苷酸的掺入率为35-100nt/s，这也取决于缓冲体系、PH值、盐浓度和DNA模板的性质等，延伸1分钟对长达2kb的扩增片段是足够的，延伸时间过长会导致非特异扩增带的出现，但在循环的最后一步延伸时，为使反应完全，提高产量，可将延伸时间延长4-10分钟。
（4）循环数 循环数决定着扩增程度，常规PCR一般为25-40周期，在其他参数交已优化的条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度，其相应关系参照下表
模板DNA分子数 需要热循环次数
3．0×105 25-30
1．5×104 30-35
1．0×103 35-40
50 40-45
循环次数太少，得不到一定的产物量；循环次数太多时，扩增反应的后期，产物积累的指数率下降甚至不再有正确的产物生成，正常的反应几乎停止，呈现平台效应。
影响出现平台效应的因素有：
A、反应试剂（dNTP或酶）稳定性的改变；
B、终产物（如焦磷酸）的抑制效应；
C、产物浓度超过10-5时可产生重复退火，于是会降低引物延伸速率或DNA聚合酶的活性
D、高浓度产物DNA双链的解链不宝剑。平台效应时的一种重要后果是由于错误引导，在开始时浓度不高的非特异产物会继续扩增，使结果的分析复杂化。
4．3引物的要求：
（1） 一般长15-30bp，常用20bp（理论上420=11×1011长的DNA片段才会有重复）。引物过长，扩增的效率降低。
（2） 碱基组成：C+G占50-60%（常规），尽量避免数个嘌呤和嘧啶的连续排列。
（3） 一对引物之间不能有2个以上的碱基互补，特别是3‘末端；引物之间的碱基互补会形成引物二聚体，引物本身应避免回文序列。
（4） 引物与模板退火的温度和所需的时间取决于引物的碱基组成、长度和溶液中引物的浓度。合适的退火温度是低于引物本身的实际变性温度（Tm）50C。20bp左右长度的DNA片段的Tm=(G+C) ×40C+(A+T) ×20C。退火火温度通常在55-720C下进行在标准的引物浓度（0.2umol/L）下，几秒内即可完成退火。提高退火温度可提高引物与模板结合的特异性。特别在最初几次循环中采用严谨的退火温度，有助于PCR特异性扩增。如果引物中（G+C）的含量小于50%，退火温度应低于550C。
（5） 100ul的PCR反应液中，引物的绝对量为10-100pmol。PCR反应液中2个引物浓度不等时，其浓度比为50:1，称为不对称PCR。
简并引物：由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。若PCR扩增引物的核苷酸组成顺序是根据氨基酸顺序推测而来，就需合成简并引物。
嵌套引物：利用第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增的起始材料，同时除使用第一轮的一对特异引物外，另加1-2个新引物（处在同一个模板DNA的头两个引物之间序列）进行第二轮扩增。通过嵌套引物扩增的产物，产生错误扩增的可能性极小，所以应用嵌套引物技术能够使靶DNA序列得到有效的选择性扩增。
PCR的的应用：基因克隆、反向PCR、不对称PCR、RT-PCR、基因的体外诱变和突变检测、基因组的比较研究

Ⅶ 请高医详解--前列腺常规和尿液常规化验单

尿液常规检查包括一般性状检查，化学检查和显微镜检查三个方面。
怎样看尿液常规报告单加入时间：2009-03-18 编辑：wangman 来源：深圳医疗网 尿液常规分析是我们经常做的一项检查。大多数医院都用尿液分析仪检测，检测项目目前有10项、11项或12项，并且报告的格式不统一，既有“+”(阳性)、“-”(阴性)，又有数字，检验项目的单位也不一样。到底该怎么阅读尿检报告呢?
尿常规项目大致可分为四大类：肾病类、糖尿病类、泌尿感染类以及其他疾病类。
肾病类项目
酸碱度(pH)、比重(SG)、隐血或红细胞(BLD、ERY)、蛋白质(PRO)和颜色(COL)。正常参考值分别为：4.6～8.0、1.005～1.030，阳性、阴性，淡黄色至深黄色。这些指标的改变可能提示有肾功能损害。
糖尿病类项目
酸碱度(pH)、蛋白、比重、糖(GLU)和酮体(KET)。这些指标的检测有助于诊断相关并发症和机体一些器官是否受到损害，如是否出现酮血症等。正常情况下，尿糖和酮体为阴性。
泌尿感染类项目
白细胞(WBC)、隐血或红细胞、亚硝酸盐(NIT)、颜色和浊度(TUR)。当泌尿系统受到细菌感染时，尿中往往出现白细胞和红细胞，尿液颜色或浊度也发生改变，亚硝酸盐有时也会为阳性。化学检测尿白细胞和隐血或红细胞只起过筛作用，临床诊断以镜检结果为准。
其他疾病类项目
主要是酸碱度、比重、胆红素(BIL)、尿胆原(URO)、颜色及其他指标。胆红素和尿胆原两项指标反映肝脏代谢血红素的能力和数量。正常情况下，尿胆红素为阴性，尿胆原为弱阳性。以上指标增高时，往往提示黄疸，尿液颜色呈黄绿色。
尿液常规分析化验单上一些项目后面出现“+”或“+++”……或数字，表明程度不同，这在医学上叫阳性结果;相反，“-”就称阴性结果。在阅读报告时，要客观地分析报告，因为有许多干扰因素影响到检测结果的准确性，如饮食因素、尿液中的一些干扰物等。当尿常规检查出现异常时，请不要太紧张和太忧虑;同样，当出现和临床表现不一致的检验结果时，也不要盲目乐观。一定要配合临床医生做进一步的检查和分析，以免延误疾病的诊断。
怎样看懂尿常规检查报告单?
尿液常规检查是健康体检的重要项目，它不仅可反映泌尿系统疾病，对糖尿病、黄疸肝炎、胆道梗阻等多种疾病的筛选也有重要意义。
1.尿蛋白(PR0)
正常尿常规检查一般无蛋白，或仅有微量。尿蛋白增多并持续出现多见于肾脏疾病。但发热、剧烈运动、妊娠期也会偶然出现尿蛋白。故尿中有蛋白时需追踪观察明确原因。
2.尿糖(GLU)
尿糖阳性要结合临床分析，可能是糖尿病，也可能是因肾糖阈降低所致的肾性糖尿，应结合血糖检测及相关检查结果明确诊断。由于尿中维生素C和阿斯匹林能影响尿糖结果，故查尿糖前24小时要停服维生素C和阿斯匹林。
3.尿红细胞(RBC)
每个高倍显微镜视野下，尿液红细胞超过5个以上，称为镜下血尿;大量红细胞时，称“肉眼血尿”，可见于泌尿系统炎症、感染、结石、肿瘤等，应加重视，并立即到泌尿专科进一步检查，以明确血尿的部位和原因。
4.尿白细胞(WBC)
每个高倍显微镜视野下，尿液白细胞超过5个以上，称白细胞尿，大量白细胞时，称脓尿，它表示尿路感染，如肾盂肾炎、膀胱炎、尿道炎等。
5.尿上皮细胞(SPC)
尿液中有少量上皮细胞临床意义不大;大量出现时，如能排除阴道分泌物污染，就要考虑泌尿系统炎症存在。此时，如加做尿上皮细胞形态检查，可确定上皮细胞的来源。
6.尿管型(KLG)
尿中出现管型，特别是颗粒管型、细胞管型都是肾脏实质性病变的标志。
7.尿潜血(ERY)
正常情况尿潜血试验阴性。尿潜血阳性同时有蛋白者，首先考虑肾脏疾病和出血性疾病，可进一步做肾功能检查;如尿蛋白阴性应到有关专科查明出血部位和性质。一般认为，下尿道出血因红细胞未被破坏，潜血可不明显。
8.尿胆原(UBG)、尿胆红素(BIL)
尿胆原和尿胆红素阳性，多提示有黄疸存在，有助于黄疸的诊断和鉴别诊断。
9.尿亚硝酸盐(NIT)尿亚硝酸盐主要用于尿路感染的过筛试验。新鲜尿时亚硝酸盐呈阴性，如标本放置时间过久或有细菌生长繁殖可呈假阳性。
为何两家医院化验结果不一样
有些人总希望通过对多个医疗单位的化验结果进行综合判断，以确定自己是否健康。但是，有时会出现在一家医院化验正常，可在另一个医院却不正常的情况。那么，为什么会出现这种情况呢?原因是多方面的。
首先，也是最常见的原因，是体检者未仔细阅读“体检须知”，留取标本不当，以致使同一个人两次检测的标本实际上并不相同。例如，抽血前是否禁食，空腹对测定结果影响很大(如血糖、血脂等);抽血前是否处于安静状态，因有些项目，如转氨酶等在剧烈运动后会升高;留取的尿液是否是晨尿，因清晨第一次尿与平时的随机尿检查结果相差较大。
其次，体检者两次体检时的身体状况不一致。如体检者是否服用了药物，有些药物会影响测定项目(如转氨酶、肌酐等)，或女性体检者是否处于月经期等。
另外，也有可能是因为两家医院的测定方法不同，使用的仪器不同造成结果有差异。另一种可能就是医务工作者责任心不强，张冠李戴，弄错了标本。
如果出现两家医院的检验结果不一致时，体检者不必惊慌，可要求医务人员作出合理的解释，并在医务人员的指导下正确留取标本，配合他们找出原因，还自己身体状况的本来面目。

Ⅷ PCR基因扩增原理

基因扩增技术（PCR）聚合酶链反应（polymerase chain reaction简称PCR）又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。由于PCR具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点，已在病原微生物学领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。
PCR技术是由Cetus公司和加利福尼亚大学1985年联合创造的，主要贡献者为Kary B mulis和HeneryA、Erlich。该方法首先被应用于人β-珠蛋白DNA的扩增及镰刀状红细胞贫血病的产前诊断。自85年首次报道PCR方法以来，PCR被广泛应用于分子克隆、序列分析、基因突变、遗传病、传染病、性传播性疾病及法医判定和考古研究等多领域、并发挥了越来越大的作用。因而发明人Kary B、mulis获1993年诺贝尔化学奖。
为了使PCR技术在临床上迅速得以普及，我们对该技术的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技术变得简单、微量化、不易发生污染，从而使PCR技术常规化成为可能。我们的方法迅速在全国各大医院得到推广。
一、PCR的基本原理和基本程序
PCR扩增DNA的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片段，一般需20-30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合。引物与互补DNA结合后，以靶DNA单链为模板，经反链杂交复性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原料按5'到3'方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。引物在反应中不仅起引导作用，而且起着特异性的限制扩增DNA片段范围大小的作用。新合成的DNA链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。如此重复上述DNA模板加热变性双链解开—引物退火复性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循环过程，使每次循环延伸的模板又增加1倍，亦即扩增DNA产物增加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。
PCR的扩增倍数Y=（1+E）n,这里Y是扩增量，n为PCR的循环次数。E为PCR循环扩增效率。设PCR扩增效率E为100%、循环次数n=25次，靶DNA将扩增到33554432个拷贝，即扩增3355万倍：若E为80%、n=20、则扩增数量将下降到1408865拷贝，即扩增产物约丢失93%，若E=100%，n=20，则扩增数量减少1048576个拷贝，扩增产物约减少97%。可见PCR循环扩增效率及循环次数都对扩增数量有很大影响。PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的逐渐积累，当引物—模板/DNA/聚合酶达到一定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再增加，即出现所谓平台效应。PCR反应达到平台期的时间主要取决于反应开始时样品中的靶DNA的含量和扩增效率，起始模板量越多到达平台期的时间就越短、扩增效率越高到达平台期的时间也越短。另外酶的含量，dNTp 浓度，非特异性产物的扩增都对到达平台期时间有影响。
二、PCR的特点
（一）特异性高：首次报导的PCR所用的DNA聚合酶是大肠杆菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃会变性失活，需每次PCR循环都要重新加入Klenow大片段，同时引物是在37℃延伸（聚合）易产生模板—引物之间的碱基错配、致特异性较差，1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的Taq DNA聚合酶，在热变性处理时不被灭活，不必在每次循环扩增中再加入新酶，可以在较高温度下连续反应，显着地提高PCR产物的特异性，序列分析证明其扩增的DNA序列与原模板DNA一致。扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一，足可以提供特异性分析，选用各型病毒相对的特异寡核苷酸引物。PCR能一次确定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物检测病妇宫颈刮片细胞可以发现部分病人存在HPV11和HPV16两型的双重感染。
（二）高度敏感：理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上，实际应用已证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。能从100万个细胞中检出一个靶细胞，或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。
（三）快速及无放射性：一般在2小时内约可完成30次以上的循环扩增，加上用电泳分析。只需3-4小时便可完成，不用分离提纯病毒，DNA粗制品及总RNA均可作为反应起始物，可直接用临床标本如血液、体液、尿液、洗液、脱落毛发、细胞、活体组织等粗制的DNA的提取液来扩增检测，省去费时繁杂的提纯程序，扩增产物用一般电泳分析即可，不一定用同位素，无放射性易于推广。
（四）简便：扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆，摆脱繁琐的基因方法，可直接从RNA或染色体DNA中或部分DNA已降解的样品中分离目的基因，省去常规方法中须先进行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的组织或切片亦可检测。如在PCR引物端事先构建一个内切酶位点，扩增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相应酶切位点的载体中。
（五）可扩增RNA或cDNA：先按通常方法用寡脱氧胸苷引物和逆转录酶将mRNA转变成单链cDNA，再将得到的单链cDNA进行PCR扩增，即使mRNA转录片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能经PCR扩增1ng有242碱基对长度的特异片段，有些外显子分散在一段很长的DNA中，难以将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作模板，则可将外显子集中，用PCR一次便完成对外显子的扩增并进行序列分析。

Ⅸ 教你如何读懂CKD

引言：

慢性肾脏病（CKD）患病率高，医疗花费大，预后差，它是继心脑血管疾病、糖尿病、肿瘤，又一个严重威胁人类健康的疾病。但是，知道和关注CKD的人却并不多，今天和大家一起学习一下。

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?6.如果有慢性肾脏病，

我该怎么办？

如果检查结果提示有慢性肾脏疾病，您应该找一位靠谱的医生，重点找一下肾病的原因，因为只有找到原因，治疗上才更有把握和有的放矢。同时医生会评估您的肾功能及全身状态，来帮助您制定治疗计划。

慢性肾脏病是典型的慢性病，您以后可能要与肾内科医生经常打交道。明智的做法是选择一位临床经验丰富且态度友好的医生，更明智的做法是选择一位您信任的医生，当然您也要听医生的话，往往依从性好的患者，治疗效果会更好。（面对生命的层面，世界上恐怕只有医生不会去害你）

当您面对疾病，您和您的家庭需要做一些生活方式以及思想观念上的调整。您需要主动配合临床技术精湛的肾脏健康团队（包括医师、健康教育护士和营养师）来帮助您，自己尽可能多地学习有关肾脏病的健康知识，知道自己将会遇到什么以及可以做些什么来可以帮到自己。

7.您需要了解，

慢性肾脏病常见检查项目

建议每年至少2次进行尿常规和肾功能的检查，了解您的疾病状态和临床分期。

常见检查有：

●尿常规：可以检查尿液中的许多异常，如血、蛋白质、脓、糖和细菌等。

●尿微量白/肌酐（ACR）：是检测尿有无蛋白质的敏感方法。

●尿蛋白/肌酐(PCR)：可以估算一天的尿液中蛋白质的排泄量，而不需要收集24小时的尿液标本。

●肾小球滤过率（GFR）：GFR是评价您肾脏功能的最好方法，医生根据您的血肌酐值、年龄、体重和性别来计算您的GFR，帮助确定您肾脏疾病的阶段。

●泌尿系统超声或CT：帮助您了解肾脏的大小，输尿管否有梗阻或膀胱肿瘤等。

●肾活检：在某些情况下需要做，来帮助确定肾脏病的具体类型、肾脏损伤的程度以及确定治疗方案。

8.您需要了解，

慢性肾脏疾病的基本治疗原则

治疗上基本的原则：一是缓解症状；二是延缓病程进展。

其主要内容包括以下几方面：

●调整生活方式：包括规律作息、避免劳累、预防感染、合理锻炼、戒烟戒酒等

●肾病营养治疗：包括蛋白质及热量的摄入、低盐饮食、其他营养物质的摄入等

●控制蛋白尿和血压：最关键的治疗

●控制血糖、尿酸和血脂水平

●慎用肾毒性药物、中草药和保健品

●慢性肾脏病并发症的防与治

●终末期肾脏病的替代治疗：腹膜透析、血液透析和肾脏移植等

2017年

“医说就懂”系列科普中，

我们再慢慢展开谈。

预祝大家新年快乐！

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Ⅹ 尿常规检查，尿蛋白2个+ 白细胞85，大概有什么问题

做下腹部B超检查肾脏和前列腺，看看是不是有炎症。
尿不尽是尿路感染或者前列腺炎症状，出现尿蛋白可能与前列腺或者肾脏疾病有关。
建议再做分泌物培养或者PCR，检查是否有支原体衣原体感染。
还有一个办法，你可以口服诺氟沙星，每次两粒，每日三次，服三天如果有效，继续服用4-7天即可。