Ⅰ 叶绿体色素的定量的测定
视频就没有。报告就有。。
实验 8 叶绿体色素的定量测定
一、原理
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯–比尔定律，某有色溶液的消光度 D 与其中溶质浓度 C 和液层厚度 L 成正比，即：
D = kCL （ 17 – 1 ）
式中： k 为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 1cm 时， k 为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的消光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总消光度等于各组分在相应波长下消光度的总和，这就是消光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素 a 、 b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在 3 个特定波长下的消光度 D ，并根据叶绿素 a 、 b 及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素 a 、 b 时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素 a 、 b 的 80 ％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为 663nm 和 645nm ，又知在波长 663nm 下，叶绿素 a 、 b 在该溶液中的比吸收系数分别为 82.04 和 9.27 ，在波长 645nm 下分别为 16.75 和 45.60 ，可根据加和性原则列出以下关系式：
D 663 = 82.04C a +9.27C b （ 17- – 2 ）
D 645 = 16.75C a +45.60C b （ 17 – 3 ）
式中： D 663 、 D 645 ——叶绿素溶液在波长 663nm 和 645nm 时的消光度；
C a 、 C b ——叶绿素 a 和 b 的浓度， mg/L 。
解方程组 17 – 2 、 17 – 3 得：
C a = 12.72D 663 – 2.59D 645 （ 17 – 4 ）
C b = 22.88D 645 – 4.67D 663 （ 17 – 5 ）
将 C a 与 C b 相加即得叶绿素总量 C T ：
C T = C a +C b =20.29D 645 + 8.05D 663 （ 17 – 6 ）
另外，由于叶绿素 a 、 b 在 652mn 的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为 34.5 ），也可以在此波长下测定一次消光度（ D 652 ）而求出叶绿素 a 、 b 总量：
C T = （ D 652 × 1000 ）／ 34.5 （ 17 – 7 ）
在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法也可以同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。 Lichtenthaler 等对 Arnon 法进行了修正，提出了 80 ％丙酮提取液中 3 种色素含量的计算公式：
C a = 12.21D 663 – 2.81D 646 （ 17 – 8 ）
C b = 20.13D 646 – 5.03D 663 （ 17 – 9 ）
C x = （ 1000D 470 – 3.27C a – 104C b ）／ 229 （ 17 – 10 ）
式中： C a 、 C b ——叶绿素 a 和 b 的浓度。
C x ——类胡萝卜素的总浓度。
D 663 、 D 646 和 D 470 ——叶绿体色素提取液在波长 663 nm 、 646 nm 和 470 nm 下的消光度。
由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素 a 、 b 在 95 ％乙醇中最大吸收峰的波长分别为 665nm 和 649nm ，类胡萝卜素为 470nm ，可据此列出以下关系式：
C a = 13.95D 665 – 6.88D 649 （ 17 – 11 ）
C b = 24.96D 649 – 7.32D 665 （ 17 – 12 ）
C x = （ 1000D 470 – 2.05C a – 114C b ） /245 （ 17 – 13 ）
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
新鲜植物叶片（或其他绿色组织）。
（二）试剂
• 95 ％乙醇（或 80 ％丙酮）。
• 石英砂。
• 碳酸钙粉。
（三）仪器设备
分光光度计，研钵 1 套，剪刀 1 把，玻棒， 25 mL 棕色容量瓶 3 个，小漏斗 3 个，直径 7 cm 定量滤纸，吸水纸，擦镜纸，滴管，电子天平（ 0.01 g 感量）。
三、实验步骤
1. 取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
2. 称取剪碎的新鲜样品 0.3 g ，共 3 份，分别放入研钵中，加入少量石英砂和碳酸钙粉及 2 ～ 3 mL95% 乙醇（或 80% 丙酮）研成匀浆，再加乙醇 10 mL ，继续研磨至组织变白，静止 3 ～ 5 min 。
3. 取滤纸 1 张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，过滤到 25mL 棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至 25 mL ，摇匀。
5. 把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。以 95 ％乙醇为空白，在波长 665 、 649 和 470 nm 下测定消光度。
6. 按公式 17 – 11 、 17 – 12 、 17 – 13 （如用 80 ％丙酮，则按公式 17 – 8 、 17 – 9 、 17 – 10 ）分别计算叶绿素 a 、 b 和类胡萝卜素的浓度（ mg/L ）， 17 – 11 、 17 – 12 式相加即得叶绿素总浓度。
四、结果计算
求得色素的浓度后再按下式计算组织中各色素的含量（用每克鲜重或干重所含叶绿体色素的毫克数表示）：
（ mg/g ）
[ 注意事项 ]
1. 为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。
2. 叶绿体色素提取液不能浑浊。可在 710 或 750 nm 波长下测量消光度，其值应小于当波长为叶绿素 a 吸收峰时消光度值的 5 ％，否则应重新过滤。
3. 用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差 l nm ，则叶绿素 a 的测定误差为 2 ％，叶绿素 b 为 19 ％，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素 a 和 b 来校正。
4. 在使用低档型号分光光度计（如： 72 、 125 、 721 型等）测定叶绿素 a 、 b 含量时，因仪器的狭缝较宽，分光性能差，单色光的纯度低（± 5 ～ 7 nm ），与高中档仪器如岛津 UV-120 、 UV-240 等测定结果相比，叶绿素 a 的测定值偏低，叶绿素 b 值偏高， a ／ b 比值严重偏小。因此，使用时必须用高档分光光度计对低档的分光光度计进行校正。
[ 思考题 ]
1 ．叶绿素 a 、 b 在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素 a 、 b 的定量分析 ? 为什么 ?
2 ．为什么提取叶绿素时干材料一定要用 80 ％的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？
【附注】 叶绿体色素简便提取方法
采用上述研磨方法提取叶绿体色素，既费工费时，又容易出现误差。为此，可采用乙醇–丙酮混合液浸泡法。其方法是，将待测叶片剪碎，装入具塞刻度试管中，加入乙醇–丙酮混合液（ 1 ∶ l ， v ／ v ） 10 mL ，使叶片完全浸入液体之中，加盖。放置于暗处，如能置于 30 ～ 40 ℃温箱中更好。当叶片完全变白时即可比色。此法简便易行，重现性好，尤其适用于大量样品的测定。最好是在浸泡过程中轻轻摇动几次。
Ⅱ 叶绿素含量测定分光光度法实验中,总叶绿素测定波长为什么选取652nm
叶绿素a的测定方法有哪些
一.单色分光光度法测定叶绿素含量时，要测定665和750nm处的吸光度．根据文献，665nm处光密度值应该在0.1-0.8之间.
叶绿素含量测定选取待测样品0.5g,用80%丙酮溶液抽提,定容到10mL,测652nm处吸光度.
计算方法方式:
计算样品叶绿素总量
Ct= D652× 1000/34.5 (1)
式中Ct-- 样品总叶绿素含量,mg/L;D652-- 样品丙酮抽提液在652nm处的吸光值。
回
二.叶绿素含量测定选取待测样品0.5g,用80%丙酮溶液抽提,定容到10mL,测652nm处吸光度.
计算方法方式:
计算样品叶绿素总量
Ct= D652× 1000/34.5 (1)
式中Ct-- 样品总叶绿素含量,mg/L;D652-- 样品丙酮抽提液在652nm处的吸光值。
Ⅲ 叶绿素计算方法
[Chla]=12.21*E663-2.81*E646
[Chlb]=20.13*E646-5.03*E663
[Chla+b]=7.18*E663+17.32*E646
Ⅳ 叶绿素a和 b的含量测定时，在一个波长不同浓度怎么计算
叶绿素a与叶绿素b含量的测定
实验目的和意义
叶绿素a与叶绿素b是高等植物叶绿体色素的重要组分，约占到叶绿体色素总量的75%左右。叶绿素在光合作用中起到吸收光能、传递光能的作用(少量的叶绿素a还具有光能转换的作用)，因此叶绿素的含量与植物的光合速率密切相关，在一定范围内，光合速率随叶绿素含量的增加而升高。另外，叶绿素的含量是植物生长状态的一个反映，一些环境因素如干旱、盐渍、低温、大气污染、元素缺乏都可以影响叶绿素的含量与组成，并因之影响植物的光合速率。因此叶绿素含量a与叶绿素b含量的测定对植物的光合生理与逆境生理具有重要意义。
实验原理
叶绿素提取液中同时含有叶绿素a和叶绿素b，二者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测定叶绿素a和叶绿素b的浓度，可分别测定在663nm和645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b的浓度。
A663=82.04Ca+9.27Cb（1）
A645=16.75Ca+45.60Cb （2）
公式中Ca为叶绿素a的浓度，Cb为叶绿素b浓度（单位为g/L），82.04和9.27分别是叶绿素a和叶绿素b在663nm下的比吸收系数（浓度为1g/L，光路宽度为1cm时的吸光度值）；16.75和45.60分别是叶绿素a和叶绿素b在645nm下的比吸收系数。即混合液在某一波长下的光吸收等于各组分在此波长下的光吸收之和。
将上式整理，可以得到下式：
Ca=0.0127A663-0.00269A645（3）
Cb=0.0229A645-0.00468A663（4）
将叶绿素的浓度改为mg/L，则上式变为：
Ca=12.7A663-2.69A645（5）
Cb=22.9A645-4.68A663（6）
CT=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645（7）
CT为叶绿素的总浓度
实验仪器及材料
实验材料：
菠菜或其它绿色植物
实验仪器及试剂：
UV-1700分光光度计；天平；剪刀；打孔器；研钵；移液管；漏斗；量筒；培养皿；滤纸；丙酮；石英砂；CaCO3；
实验步骤
提取叶绿素
选取有代表性的菠菜叶片数张，于天平上称取0.5g，（也可用打孔器打取一定数量的叶圆片，计算总的叶面积），剪碎后置于研体中，加入5ml 80%丙酮，少许CaCO3和石英砂。仔细研磨成匀浆，用滤斗过滤到10ml量筒中，注意在研钵中加入少量80%丙酮将研钵洗净，一并转入研钵中过滤到量筒内，并定容至10ml。将量筒内的提取液混匀，用移液管小心抽取5ml转入25ml量筒中，再加入80%丙酮定容至25ml（最终植物材料与提取液的比例为W：V＝0.5：50＝1：100，叶色深的植物材料比例要稀释到1：200）。
测量光吸收
利用722分光光度计或UV1700分光光度计，分别测定叶绿素提取液在645nm和663nm下的吸光度。
结果分析
将测得的数值代入到公式（5）（6）（7）中，计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的浓度。最后要计算出单位叶片鲜重中叶绿素的含量：
叶绿素a含量(mg/g鲜重)＝Ca×50ml（总体积数）×1ml/1000ml/L ÷0.5g=0.1Ca
叶绿素b含量(mg/g鲜重)＝0.1Cb
总叶绿素含量(mg/g鲜重)＝0.1CT
讨论：
1． 叶绿素在兰光区的吸收峰高于红光区的吸收峰，为何不用兰光区的光吸收来测定叶绿素的含量。
2． 计算叶绿素a与叶绿素b含量的比值，可以得到什么结论？
3． 比较阳生植物和阴生植物的叶绿素a和叶绿素b的含量以及比例，可以得到什么结论
Ⅳ 相对叶绿素含量的算法
叶绿素含量的测定：
根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A值与其中溶质浓.度C以及光径L成正比，即A=aCL。[)各种有色物质溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下的吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素提取液中叶绿素a、b含量，只需测定该提取液在2个特定波长下的吸光度度值，并根据叶绿素a与b在该波长下的吸光系数即可求出各自的浓度。在测定叶绿素a、b含量时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长应选择叶绿系在红光区的最大吸收峰。
Ⅵ 叶片中叶绿素a的含量是多少，假如有了吸光度应该如何计算
叶绿体色素在不同溶剂中的吸光光谱有差异
1.如果是80%的丙酮提取液，叶绿素a和叶绿素b在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm；
在663nm下叶绿素a和叶绿素b在溶液中的吸光系数分别为82.04和9.27，在645nm下下叶绿素a和叶绿素b在溶液中的吸光系数分别为16.75和45.6；
由加和性原则有
（1）A663=82.04×Ca+9.27×Cb; (2)A645=16.75×Ca+45.60×Cb
(A663和A645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的吸光度，Ca和Cb为叶绿素a和叶绿素b的浓度，单位：mg/L，以下同理类推)
解得上方程组知：
Ca=12.72×A663-2.59×A645; Cb=22.88×A645-4.67×A663
(注意：还有修正的式子波长646nm下Ca=12.21×A663-2.81×A646)
2.如果是95%乙醇提取液，叶绿素a和叶绿素b的最大吸收峰波长分别为665nm和649nm； 同理可以得到一下关系式 ：
Ca=13.95×A665-6.88×A649; Cb=24.96×A649-7.32×A665
注（知识点来源）：高等教育出版社；王学奎 主编；《植物生理生化实验原理和技术》（第二版）
Ⅶ 关于叶绿素的化验方法和计算公式
介绍:叶绿素是由叶绿酸、叶绿醉和甲醇组成的二醇酷，是四毗咯衍生物，
其中的叶琳环是处于二氢形式，中心的金属原子为镁。蔬菜中的叶绿素有叶绿素a和叶绿素b两类。叶绿素在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿素蛋白
质，由多种叶绿素蛋白复合物构成叶绿体，当细胞死亡之后，叶绿素就游离出来。叶绿 素 是 一种不稳定的物质.不耐光、热、酸、不溶于水，易溶于碱、乙醉与乙醚，在碱性溶液中，皂化为叶绿素碱盐。
检验方法:
叶绿素含量测定选取待测样品0.5g,用80%丙酮溶液抽提,定容到10mL,测652nm处吸光度.
计算方法方式:
计算样品叶绿素总量
Ct= D652× 1000/34.5 (1)
式中Ct-- 样品总叶绿素含量,mg/L;D652-- 样品丙酮抽提液在652nm处的吸光值。
Ⅷ 叶绿素含量测定中的稀释倍数怎么算
一、原理
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料：新鲜(或烘干)的植物叶片
(二)仪器设备：1.分光光度计；2.电子顶载天平(感量0.01g)；3.研钵；4.棕色容量瓶；5.小漏斗；6.定量滤纸；7.吸水纸；8.擦境纸；9.滴管。
(三)试剂：96％乙醇(或80％丙酮)；石英砂；碳酸钙粉。
三、实验步骤
1. 取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，剪碎(去掉中脉)，混匀。
2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。
3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。
四、实验结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A665－6.88A649；Cb=24.96A649－7.32A665。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度(Ca、Cb：mg/L)，二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：
叶绿素的含量(mg/g)=[叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重(或干重)。
Ⅸ 叶绿素a的测定方法有哪些各有哪些优缺点
叶绿素a的测定方法有哪些
一.单色分光光度法测定叶绿素含量时，要测定665和750nm处的吸光度．根据文献，665nm处光密度值应该在0.1-0.8之间.
叶绿素含量测定选取待测样品0.5g,用80%丙酮溶液抽提,定容到10mL,测652nm处吸光度.
计算方法方式:
计算样品叶绿素总量
Ct= D652× 1000/34.5 (1)
式中Ct-- 样品总叶绿素含量,mg/L;D652-- 样品丙酮抽提液在652nm处的吸光值。
回
二.叶绿素含量测定选取待测样品0.5g,用80%丙酮溶液抽提,定容到10mL,测652nm处吸光度.
计算方法方式:
计算样品叶绿素总量
Ct= D652× 1000/34.5 (1)
式中Ct-- 样品总叶绿素含量,mg/L;D652-- 样品丙酮抽提液在652nm处的吸光值。