抗生素测序算法

㈠ 16srRNA的测序结果怎么分析

原核生物的30S核糖体亚基中含有16S rRNA.16S rRNA的相对分子质量约为0.6 MDa,长度约为1540 nt.在30S核糖体亚基组装过程中,16S rRNA与其核糖体蛋白质S4、S7、S8、S15、S17和S20结合先行成初级复合物.
16S rRNA约有一半的核苷酸形成链内碱基对,使其具有约60个螺旋；分子中未配对部分则形成突环.在浓度足够的Mg2+存在下分离得到的16S rRNA处于紧密状态,与30S核糖体亚基的结构相似.已发现16S rRNA中的一些序列与蛋白质合成时30S核糖体亚基、mRNA及一些翻译因子的结合有关.核糖体16S rRNA的3'端能识别待翻译mRNA的5'端的夏因-达尔加诺序列,起始翻译.另有研究表明,16S rRNA也能与进入核糖体P位点的tRNA相互作用.
16S rRNA作为研究分类学和系统进化的分子受到很大重视,16S rRNA序列分析是当前对细菌进行分类学研究中较精确的一种技术.随着分子生物学的快速发展以及该技术在医学微生物研究中的应用,对16S rRNA作为微生物分类依据的研究也逐渐发展起来并已得到广泛认同.
位于原核生物70S核糖体A位点的16S rRNA部分的是氨基糖苷类抗生素的作用靶位,该类抗生素通过与16S rRNA的A位点结合而阻碍原核翻译.但由质粒介导的16S rRNA甲基化酶能将16S rRNA甲基化,从而导致细菌产生对该类抗生素较高的抗性.

㈡ 为什么转座子测序可以测定固有耐药基因

肠球菌由于其细胞壁坚厚，对许多抗生素表现为固有耐药。其耐药性包括固有耐药、获得性耐药及耐受性3种。肠球菌对青霉素敏感性较差，对头孢菌素类耐药。肠球菌对青霉素耐药的主要机制为细菌产生一种特殊的青霉素结合蛋白（PBP5），后者与青霉素的亲和力减低，从而导致耐药。此种耐药以屎肠球菌多见。青霉素不能致肠球菌自溶，因此对肠球菌而言，青霉素为抑菌作用，而非杀菌作用。少数情况下，细菌产生大量青霉素酶而引起耐药，但通常用头孢硝噻吩（Nitrocefin）纸片不易获阳性结果，因此其确切发生率可能被低估。肠球菌对氨基糖苷类的耐药性有2种：①中度耐药性（MIC62～500mg/L），系细胞壁渗透障碍所致，此种耐药菌对青霉素或糖肽类与氨基糖苷类合用敏感；②高度耐药性（庆大霉素MIC≥500mg/L、链霉素≥2000mg/L），系细菌产生质粒介导的氨基糖苷类钝化酶APH（2”）-AAC（6”）所致，此种耐药使青霉素或糖肽类与氨基糖苷类的协同作用消失。因此测定氨基糖苷类的耐药程度，对于临床治疗有重要参考意义。虽然体外药敏显示肠球菌对磺胺甲恶唑-甲氧苄啶敏感，但由于体内肠球菌可利用外源叶酸，故使该药失去抗菌作用。肠球菌对万古霉素的耐药性有3种：①VanA型，对万古霉素、壁霉素均高度耐药，由位于Tn1546转座子上的VanA基因编码；②VanB型，对万古霉素呈不同程度耐药，MIC4～1024mg/L，对壁霉 素敏感，由位于染色体上的VanB基因编码；③Van型，由位于染色体上的VanC基因编码，本型少见且无临床意义。

㈢ 质粒扩增不出来是什么原因（质粒，抗生素，菌落

质粒和PCR产物需要拿去测序有2个目的，一是验证插入序列的DNA序列是否无误。第二是看插入的方向和位置是否正确。如果做定量PCR用到质粒的话，一般是用来做标准曲线的。聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中兇手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1973 年，台籍科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。 PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

㈣ 高通量测序可以知道某一菌群的丰度吗

高通量测序技术在肠道菌群多样性研究中的应用
在人体肠道中生活着数以万亿的共生菌群，它们的种类繁多，可达上千种，数量也很惊人，是人体细胞总量的10倍以上，迄今为止，仍有80%以上的微生物不为人知。这些肠道微生物和人体存在着互利共生的关系，对于维持人类的健康发挥着重要的作用。它们在肠道中保持着一种动态的平衡，能够合成维生素、帮助人体从食物中吸收营养、维持肠道免疫系统功能、抵挡有害微生物的侵害，但是当这种平衡因某些因素被打破致使肠道菌群发生紊乱时，人体就可能患上诸如肥胖症、糖尿病、肠炎甚至癌症等疾病。为了加深对人类疾病发生原因、药物作用机理的理解，继人类基因组计划之后，科学家们又启动了人类元基因组计划，这使肠道菌群的研究迎来了一个新的浪潮。
在以往的肠道微生物群落多样性研究中，人们主要采用DGGE等分子生物学方法及生物芯片对肠道菌群进行研究，但是这些方法都存在一定的缺陷。如DGGE只能检测到环境样品中十几种优势菌，但是对痕量微生物却束手无策；电泳条带中包含不只一种16S rDNA序列，要获悉具体的菌种信息，还需进行克隆、测序，实验操作繁琐；此外，采用这种方法不能反映微生物的丰度情况。而生物芯片通过固定在芯片上的探针来获得微生物多样性的信息，“只能验证已知，却无法探索未知”，通过信号强弱判断微生物的丰度也不是非常的准确。新一代高通量测序技术自2005年问世以来，以其数字化信号、高数据通量、高测序深度、高准确率等特点，已被广泛的应用于肠道菌群的研究中，发表的论文达60多篇，其中不乏发表于Nature、PNAS、Genome Res、Gut、Gastroenterology等国际顶尖杂志上的文章。Roche 454测序平台由于读长较长，达300～500bp，能跨越16S rDNA序列一个或几个可变区，是微生物多样性研究的最佳平台，使用该平台发表的关于肠道菌群的论文达50多篇。美吉生物拥有Roche 454测序平台，在肠道微生物群落多样性研究方面积累了大量的成功案例。
美吉生物研究人员通过大量相关文献的阅读，发现高通量测序技术在肠道菌群多样性研究中的应用主要聚焦于以下几个方面：① 饮食、能量摄取、肥胖与肠道菌群之间的关系；② 肠道菌群与疾病发生之间的关联；③ 抗生素治疗对肠道菌群的影响；④ 不同个体肠道微生物群落结构及其受其他外界因素（压力、致病菌感染、手术）的影响等。下文对其中的一些文章进行了介绍：
一、饮食、能量摄取、肥胖与肠道菌群之间的关系
1. A core gut microbiome in obese and lean twins--2009《Nature》
Turnbaugh PJ等人对胖瘦不同的同卵双胞胎（31对）、异卵双胞胎（23对）及其母亲（46个）共154个个体的肠道微生物进行了研究。采用454高通量测序平台测定了这些个体中微生物16S rRNA基因的V2和V6区，并选取了18个个体，测定了其肠道微生物群落的DNA。结果表明肥胖与肠道门级微生物的变化相关，胖人与瘦人相比，微生物多样性明显降低，拟杆菌门（Bacteroidetes）所占比例较低而放线菌门（Actinobacteria）所占比例较高。Shotgun reads与多个数据进行比对，发现不同个体中含有大量共有的微生物基因，在基因水平上可将它们定义为“核心微生物组”，而个体中的微生物与核心微生物组的偏离，则与各种不同的生理状态相关（如胖瘦）。
2. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa--2010《PNAS》
为了研究饮食对肠道微生物群落多样性的影响，Filippo CD等人采用454高通量测序技术比较了15个健康欧洲孩子（EU）及14个健康非洲农村孩子（BF）肠道微生物群落的组成。EU的饮食具有典型的西方特色，而BF的食物则能代表传统的非洲乡下的饮食构成。研究人员通过PCR扩增29个粪便样品的16S rRNA基因V5-V6区DNA片段并进行高通量测序，共获得了438,219条高质量的reads。RDP数据库比对结果显示94.2%的reads属于放线菌门（Actinobacteria），拟杆菌门（Bacteroidetes），壁厚菌门（Firmicutes）和变形杆菌门（Proteobacteria），然而它们在EU和BF中的比例具有显着差异。BF肠道中拟杆菌占大部分，而壁厚菌所占比例较低。有趣的是，含有大量纤维素和木聚糖水解基因的Prevotella和Xylanibacter菌株只存在于BF中，并且所占比例较高。

㈤ 16srRNA的测序结果怎么分析啊谢谢！！！！！

原核生物的30S核糖体亚基中含有16S rRNA.16S rRNA的相对分子质量约为0.6 MDa,长度约为1540 nt.在30S核糖体亚基组装过程中,16S rRNA与其核糖体蛋白质S4、S7、S8、S15、S17和S20结合先行成初级复合物.
16S rRNA约有一半的核苷酸形成链内碱基对,使其具有约60个螺旋；分子中未配对部分则形成突环.在浓度足够的Mg2+存在下分离得到的16S rRNA处于紧密状态,与30S核糖体亚基的结构相似.已发现16S rRNA中的一些序列与蛋白质合成时30S核糖体亚基、mRNA及一些翻译因子的结合有关.核糖体16S rRNA的3'端能识别待翻译mRNA的5'端的夏因-达尔加诺序列,起始翻译.另有研究表明,16S rRNA也能与进入核糖体P位点的tRNA相互作用.
16S rRNA作为研究分类学和系统进化的分子受到很大重视,16S rRNA序列分析是当前对细菌进行分类学研究中较精确的一种技术.随着分子生物学的快速发展以及该技术在医学微生物研究中的应用,对16S rRNA作为微生物分类依据的研究也逐渐发展起来并已得到广泛认同.
位于原核生物70S核糖体A位点的16S rRNA部分的是氨基糖苷类抗生素的作用靶位,该类抗生素通过与16S rRNA的A位点结合而阻碍原核翻译.但由质粒介导的16S rRNA甲基化酶能将16S rRNA甲基化,从而导致细菌产生对该类抗生素较高的抗药性.

㈥ 请问，卫生部是否公布了抗生素DDD值的概念和计算方法

DDD值是每日限定一种抗生素必须使用在某个值。卫生部专门有一个表单。网络文库上就有，搜一下就行。还有相关的ddd算法。

㈦ 基因克隆的基本步骤有哪些

基因克隆的基本步骤流程如下：

一、目的DNA片段的获得：

DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。

由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。

二、载体的选择：

基因克隆常用的载体有：质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体、单链DNA噬菌体载体、噬粒载体及酵母人工染色体等。从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体、表达载体、测序载体、穿梭载体等。

三、体外重组：

体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有黏性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为黏末端连接。

当目的DNA片断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，但连接效率比黏端相连差些。有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插入到带有黏末端的表达载体实现表达时，则要将平端DNA分子通过一些修饰；

如同聚物加尾，加衔接物或人工接头，PCR法引入酶切位点等，可以获得相应的黏末端，然后进行连接，此为修饰黏末端连接。

四、导入受体细胞：

载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组DNA分子。

五、重组子的筛选：

从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。发展起来的成熟筛选方法如下：

（1）插入失活法：外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法（白色菌落是重组质粒）。

（2）PCR筛选和限制酶酶切法：提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。

（3）核酸分子杂交法：制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。

（4）免疫学筛选法：获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体，也可从目的基因部分ORF片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。

(7)抗生素测序算法扩展阅读：

基因克隆的注意事项：

1、平端连接：DNA连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接。原则上讲，限制酶切割DNA后产生的平端也属配伍末端，可彼此相互连接；若产生的粘性末端经特殊酶处理，使单链突出处被补齐或削平，变为平端，也可实行平端连接。

2、加尾连接：同聚物加尾连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移酶作用下，在DNA片段端制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。这是一种人工提高连接效率的方法，也属于粘性末端连接的一种特殊形式。

3、人工接头连接：对平端DNA片段或载体DNA，可在连接前将磷酸化的接头(linker)或适当分子连到平端，使产生新的限制性内切酶位点。再用识别新位点的限制性内切酶切除接头的远端，产生粘性末端。

㈧ 基因原核表达的详细过程

构建人resistin基因原核表达载体并观察其表达，为开展对resistin的研究打下实验基础。【方法】 酚氯仿一步法从一位2型糖尿病合并胆管癌患者腹壁皮下脂肪组织抽取总RNA，RT-PCR法扩增出resistin基因cDNA，经测序后，PCR产物亚克隆入T载体，用EcoRI和KpnI分别酶切重组T质粒和原核表达载体pGENKS，然后resistin基因片段和表达载体通过T4DNA连接酶进行定向连接，用核酸内切酶EcoRI、KpnI酶切和测序方法鉴定出重组表达质粒。重组表达质粒转化大肠杆菌JM109,经1mmlo/L IPTG在32℃诱导表达2h，裂解细菌，进行PAGE凝胶电泳鉴定融合蛋白的表达。【结果】RT-PCR扩增产物分子大小为327bp，序列分析表明为人resistin基因完整编码区。PCR产物与T载体连接、转化大肠杆菌后，从细菌质粒中酶切回收了目的片段。重组表达质粒经EcoRI和KpnI双酶切后能产生出327bp、4980bp大小的两个片段，序列分析表明重组表达质粒包含人resistin基因完整编码区，基因编码无移位，PAGE凝胶电泳表明在细菌裂解上清有分子质量为39.5kD的融合蛋白。【结论】 成功构建了人resistin基因原核表达载体，且构建的载体能表达出含目的蛋白的融合蛋白，为下一步研究打下了实验基础。

第一节 MRNA
一、 原核生物MRNA的结构
二、 真核生物MRNA的结构
第二节 遗传密码
一、 遗传密码的破译
二、 遗传密码的特点
第三节 核糖体
一、 核糖体的结构与组成
二、 RRNA与核糖体蛋白的结构与功能
(一)、 rRNA的结构与功能
(二)、 核糖体蛋白的结构与功能
第四节 蛋白质合成的机理
一、 氨酰TRNA合成酶：氨基酸的活化和氨酰TRNA的合成
(一)、 活化
(二)、 连接
二、 蛋白质合成的一般过程
(一)、 翻译起始
(二)、 延伸
(三)、 终止
(四)、 翻译后加工
三、 原核生物的蛋白质合成
(一)、 翻译起始
(二)、 延伸
1、 新氨酰tRNA入位
2、 肽键形成（转肽）
3、 核糖体移位。
(三)、 终止
(四)、 原核生物的翻译后加工
1、 切除加工
2、 糖基化
3、 甲基化
4、 磷酸化
(五)、 原核生物的翻译调控
四、 真核生物的蛋白质合成
(一)、 翻译起始
(二)、 延伸
1、 入位
2、 肽键形成（转肽）
3、 移位
(三)、 终止
(四)、 真核生物的翻译后加工
1、 切除加工
2、 糖基化
3、 羟基化
4、 磷酸化
5、 亲脂修饰
6、 甲基化
7、 二硫键形成
(五)、 真核生物的翻译调控
1、 mRNA向细胞质的运输
2、 mRNA的稳定性
3、 翻译的负调控
4、 起始因子磷酸化。
5、 translational frameshifting
五、 蛋白质合成后的定向转运
(一)、 信号肽: 翻译转运同步机制
(二)、 翻译后转运机制（posttranslational translocation）
六、 蛋白质的折叠

对于终产物为RNA的基因，只要进行转录及转录后的处理，就完成了基因表达的全过程。而对于终产物是蛋白质的基因，还必须将mRNA翻译成蛋白质。
因此，蛋白质是基因表达的最终产物（基因表达的最终产物还包括tRNA、rRNA及其他RNA），蛋白质的生物合成过程实质上也是基因表达的一个过程，它包括转录和翻译。从化学的角度讲，蛋白质的合成就是20种基酸按照特定地顺序聚合成多肽并按照一定的折叠机制折叠成最终的活性构象状态。那么，我们要问，在生物体内是谁直接决定着蛋白质合成的氨基酸顺序从而最终主宰了它的高级结构和功能的呢？mRNA。
根据中心法则，DNA特定的碱基次序A、T、G、C就象一串密码（称为遗传密码），首先经过转录作用，DNA的A、T、G、C碱基序列严格按照碱基配对原则被复制成mRNA的A、U、G、C序列，于是mRNA就直接充当了蛋白质合成的模板，mRNA的A、U、G、C序列被转变成蛋白质的氨基酸序列，这种转变是一个质的飞跃，称为翻译，就好象把一种语言（碱基序列）翻译成另一种语言（氨基酸序列）。
那么在翻译过程中就有两个关键性地问题：（1）遗传密码（碱基序列）到底是怎样决定氨基酸序列的呢？也就是说什么样的碱基序列决定什么样的氨基酸序列呢？（2）通过什么样的方式或机制实现碱基序列到氨基酸序列的转变？因为氨基酸不能与碱基配对，因此一个碱基序列显然不能象转录一样简单地直接转换成氨基酸序列，而必须通过一种中间分子（又称接头分子）的媒介作用来实现，而且这种接头分子要能同时识别碱基序列和它所决定的氨基酸序列。这种接头就是tRNA分子。
需要指出的是蛋白质的合成是一个复杂的过程，包括翻译、翻译后加工和定向输送以及正确折叠，而且到现在为止，其中的许多重要方面仍在研究之中。
真核生物蛋白质的合成，需要300多种生物大分子协同工作：核糖体RNA及结合蛋白、各种酶、各种tRNA、加工修饰酶等。
蛋白质合成的场所：标记各种a.a，注入大鼠体内，在不同时间取出肝脏，匀浆，离心分离各种亚细胞器，分析放射性蛋白的分布，证实蛋白质的合成是在核糖体上进行的。
首先认识一下mRNA、遗传密码、和核糖体，然后再深入学习蛋白质合成的细节过程。
第一节 mRNA
mRNA的概念首先是由F.Jacob和J.Monod1965年提出来的．因为当时已经知道编码蛋白质的遗传信息载体DNA是在细胞核中，而蛋白质的合成是在细胞质中，于是就推测，应该有一种中间信使在细胞核中合成后携带上遗传信息进入细胞质中指导蛋白质的合成，后来经过众多科学家的实验，发现了除rRNA和tRNA之外的第三种RNA,它起着这种遗传信息传送的功能, 称为信使RNA(mRNA)。mRNA的半衰期很短,很不稳定,一旦完成其使命后很快就被水解掉。
原核生物和真核生物mRNA的结构差异教大，尤其是在5’端。
一、 原核生物mRNA的结构

（1） 5’端SD序列
P404-P405
在起始密码子AUG上游9-13个核苷酸处，有一段可与核糖体16S rRNA配对结合的、富含嘌呤的3-9个核苷酸的共同序列，一般为AGGA，此序列称SD序列。它与核糖体小亚基内16S rRNA的3’端一段富含嘧啶的序列 GAUCACCUCCUUA-OH（暂称反SD序列）互补，形成氢键。使得结合于30S亚基上的起始tRNA能正确地定位于mRNA的起始密码子AUG。
（2） 原核mRNA分子，许多是多顺反子。
转译时，各个基因都有自己的SD序列、起始密码子、终止密码子，分别控制其合成的起始与终止，也就是说，每个基因的翻译都是相对独立的。如E.coli，一个7000b的mRNA编码5种与Trp合成有关的酶
二、 真核生物mRNA的结构
（1） 真核生物mRNA5’端均具有m7GpppN帽子结构，无SD序列。
帽子结构具有增强翻译效率的作用。若起始AUG与帽子结构间的距离太近（小于12个核苷酸），就不能有效利用这个AUG，会从下游适当的AUG起始翻译。当距离在17-80个核苷酸之间时，离体翻译效率与距离成正比。
（2） 真核生物mRNA通常是单顺反子。
真核mRNA具有“第一AUG规律”，即当5’端具有数个AUG时，其中只有一个AUG为主要开放阅读框架的翻译起点。起始AUG具有二个特点：
（1）AUG上游的 -3经常是嘌呤，尤其是A。
（2）紧跟AUG的 +4常常是G。
起始AUG邻近序列中，以ANNAUGGN的频率最高。若-3不是A，则+4必须是G。无此规律的AUG，则无起始功能。
有关mRNA发现及其证实的细节看书P391.
第二节 遗传密码
我们已经知道,多肽上氨基酸的排列次序最终是由DNA上核苷酸的排列次序决定的，而直接决定多肽上氨基酸次序的是mRNA上的核苷酸的排列次序,不论是DNA还是mRNA都是由4种核苷酸构成，而组成多肽的氨基酸有20种,显然,必须是几个核苷酸的组合编码一个氨基酸才能应付局面.用数学方法很容易算出,如果每2个核苷酸编码1个氨基酸,那么4种核苷酸只有16中编码方式，显然不行,如果每3个核苷酸编码1个氨基酸,则有64种编码方式,很理想,如果4对1则有256种,太没必要也太复杂了,时刻记住生物体是一个最理想的体系.而且科学家们用生物化学实验已经证实是3个碱基编码1个氨基酸,称为三联体密码或密码子。那么让我们看一下遗传密码是如何破译的。
一、 遗传密码的破译
在遗传密码的破译中,美国科学家M.W.Nirenberg等人做出了重要贡献 ,并于1968年获得了诺贝尔生理医学奖.
早在1961年，M.W.Nirenberg等人在大肠杆菌的无细胞体系中外加poly(U)模板、20种标记的氨基酸，经保温后得到了多聚phe-phe-phe，于是推测UUU编码phe。利用同样的方法得到CCC编码pro，GGG编码gly，AAA编码lys。
如果利用poly（UC），则得到多聚Ser-Leu-Ser-Leu，推测UCU编码Ser，CUC编码Leu，因为poly（UC）有两种读码方式：UCU——CUC和CUC——UCU
采用这种方式，到1965年就全部破译了64组密码子，见表P394。
二、 遗传密码的特点
在64个密码子中有61个编码氨基酸，3个不编码任何氨基酸而起肽链合成的终止作用，称为终止密码子，它们是UAG、UAA、UGA，密码子AUG（编码Met）又称起始密码子。
密码子：mRNA上由三个相邻的核苷酸组成一个密码子，代表肽链合成中的某种氨基酸或合成的起始与终止信号。
（1）方向性：从mRNA的5’到3’
（2）连读性
编码一个肽链的所有密码子是一个接着一个地线形排列，密码子之间既不重叠也不间隔，从起始密码子到终止密码子构成一个完整的读码框架（不包括终止子），又称开放阅读框架（ORF）。那么如果在阅读框中插入或删除一个碱基就会使其后的读码发生移位性错误（称为移码）。
需要指出的是，两个基因之间或两个ORF之间可能会互相部分重叠（共用部分序列）。
（3）简并性
几种密码子编码一种氨基酸的现象称为密码子的简并性。如GGN（GGA、GGU、GGG、GGC）都编码Gly，那么这4种密码子就称为Gly的简并密码。只有Met和Trp没有简并密码。一般情况下密码子的简并性只涉及第三位碱基。
 问题：简并性的生物学意义？
A、可以降低由于遗传密码突变造成的灾难性后果
试想，如果每种氨基酸只有一个密码子，那么剩下的44个密码子都了终止子，如果一旦哪个氨基酸的密码子发生了单碱基的点突变，那么极有可能造成肽链合成的过早终止。如GUU编码Ala，由于简并性的存在，不论第三位的U变成什么，都仍然编码Ala
B、可以使 DNA上的碱基组成有较达的变化余地，而仍然保持多肽上氨基酸序列不变（意思基本同上）。
（4）摇摆性
密码子中第三位碱基与反密码子第一位碱基的配对有时不一定完全遵循A-U、G-C的原则，也就是说密码子的碱基配对只有第一、二位是严谨的，第三位严谨度低，Crick把这种情况称为摇摆性，有人也称摆动配对或不稳定配对。显然，密码子的第三位和反密码子的第一位是摇摆位点。
具体说来，反密码子第一位的G可以与密码子第三位的C、U配对，U可以与A、G配对，另外反密码子中还经常出现罕见的I，可以和密码子的U、C、A配对，这使得该类反密码子的阅读能力更强。见表P396
 问题：细胞内有几种tRNA？
当遗传密码破译后，由于有61个密码子编码氨基酸，于是人们预测细胞内有61种，但事实上绝大多数细胞内只有50种左右，Crick也正是在这种情况下提出了摇摆假说并合理解释了这种情况。
根据摇摆性和61个密码子，经过仔细计算，要翻译61个密码子至少需要31种tRNA，外加1个起始tRNA，共需32种。但是，在叶绿体和线粒体内，由于基因组很小用到的密码子少，那么，叶绿体内就有30种左右tRNAs，线粒体只有24种。
（5）通用性：密码子在不同物种间几乎是完全通用的。
目前只发现线粒体和叶绿体内有列外情况，这也是如火如荼的转基因的前提。但要注意的是不同生物往往偏爱某一种密码子。
第三节 核糖体
核糖体又称核蛋白体，它是蛋白质合成的场所：标记各种a.a，注入大鼠体内，在不同时间取出肝脏，匀浆，离心分离各种亚细胞器，分析放射性蛋白的分布，证实蛋白质的合成是在核糖体上进行的。对于真核细胞来说，核糖体按其在细胞质中的位置分为游离核糖体（合成细胞质蛋白）和内质网核糖体（合成分泌蛋白和细胞器蛋白）。
不论原核细胞还是真核细胞，一条mRNA可以被同时几个核糖体阅读，把同时结合并翻译同一条mRNA的多个核糖体称为多核糖体。
一、 核糖体的结构与组成
核糖体是由核糖核酸（称为核糖体核酸, rRNA）和几十种蛋白质分子（核糖体蛋白）组成的一个巨大的复合体。不同类型生物中核糖体的结构高度保守，尽管其rRNA和核糖体蛋白的一级结构有所不同，但其三级结构却惊人的相似。
核糖体的大亚基上有两个重要的位点：P位点是结合肽酰tRNA的肽酰基的位点，A位点是结合氨酰tRNA的氨酰基的位点。
每个核糖体是由大小两个亚基组成，每个亚基都有自己不同的rRNA和蛋白质分子，表P307
二、 rRNA与核糖体蛋白的结构与功能
(一)、 rRNA的结构与功能
结构：有大量的茎环（发夹）结构，结构复杂，可能是核糖体的钢筋骨架。
功能：
（1）蛋白质合成的施工平台（骨架）
（2）催化肽键形成的转移酶活性存在于23SrRNA上
有人小心的去掉细菌核糖体的蛋白质组分，保持rRNA的相对完整性，发现蛋白质的合成仍可进行。
（3）参与tRNA与mRNA的结合
可能的情况是：mRNA先识别rRNA的特定序列并结合固定下来,然后tRNA再识别并固定到rRNA特定的部位，其反密码子才与mRNA密码子配对。已经知道16SrRNA上有一段序列与原核mRNA上的SD序列相结合。
（4）在大小亚基的聚合中起重要作用
（5）在翻译的校正和翻译的调控方面有重要功能（如可结合调控因子）
总的来说，RNA分子似乎是整个核糖体的活跃的活性中心。
(二)、 核糖体蛋白的结构与功能
结构：大多数核糖体蛋白呈纤维状（可能起骨架作用），少数呈球状（可能起生物功能）。
功能：
(1)维持核糖体的结构
(2)新发现：一些核糖体蛋白具有DNA结（Heilix—turn—Heilix模块）；还有些真核核糖体蛋白具有DNA修复功能
问题：
既然蛋白质是在核糖体中合成的，那么第一个核糖体中的蛋白组分又是怎样合成的？第一个核糖体又是怎样出现的？
先有DNA还是先有蛋白质？
大多数科学家越来越支持RNA起源论，既然核糖体中既有蛋白质又有RNA，那么彻底搞清楚核糖体的结构与功能及其起源也许会弄清生命的起源和演化。
RNA起源论：
第一个生活细胞里出现的是RNA分子，他同时具有信息储藏和生物演化的双重特性，也就是说既可以在一定程度上复制自己，又可以催化一些最初的生化反应，后来，随着活细胞的进化，DNA逐渐出现并成为更为稳定的遗传信息储存分子。
第四节 蛋白质合成的机理
真核生物和原核生物在蛋白质合成方面有许多共同之处，因此，我们先学习蛋白质合成的一般过程，然后分别看一下原核和真核蛋白质合成的具体过程。
游离氨基酸在掺入肽链以前必须活化以获得额外的能量，每一种游离氨基酸首须在专一的氨酰tRNA合成酶的帮助下与专一的tRNA相连（有人称装载，LOAD），然后由tRNA负责将它带到核糖体上的特定位点（A位点上）并添加到正在合成的肽链C末端，这种从游离氨基酸到形成氨酰tRNA的过程既是氨基酸的活化过程，也是肽链每合成一步或延伸一步的必经准备阶段。下边我们先看一下这个过程是怎样完成的？
一、 氨酰tRNA合成酶：氨基酸的活化和氨酰tRNA的合成
基酸的活化和氨酰tRNA的合成是蛋白质生物合成的第一步，由氨酰tRNA合成酶催化。氨酰tRNA合成酶既能识别氨基酸，又能识别tRNA。
(一)、 活化
在Mg2+的存在下，氨酰tRNA合成酶首先识别并结合专一的配体氨基酸，然后氨基酸的羧基与细胞环境中的ATP发生反应形成一个酸酐型的高能复合物（氨酰AMP中间复合物）。该中间复合物暂时结合在酶上。

氨基酸 + ATP 氨酰AMP-酶 + PPI
(二)、 连接
由于氨酰tRNA合成酶上还存在专一的tRNA识别位点，因此特定的游离tRNA就会识别并结合到氨酰AMP-酶复合物的活性部位，此时氨基酸就会被转移到tRNA的3端，其羧基与tRNA 3端的自由-OH形成氨酰酯键，从而形成氨酰tRNA，这也是一个高能化合物，其能量足以形成肽键。由于氨酰tRNA能量低于氨酰AMP，所以这一过程是可以自发的。

氨酰AMP-酶 氨酰tRNA + AMP + 酶

氨基酸一旦与tRNA形成氨酰tRNA后进一步的去向就由tRNA来决定了，tRNA凭借自身的反密码子与mRNA上的密码子相识别，从而把所携带的氨基酸送到肽链的 一定位置上。每一个密码子对应的肽链位置上都能掺入正确的氨基酸。
结论：
（1）氨基酸的活化和氨酰tRNA的合成是蛋白质生物合成的第一步，每一种氨基酸在被掺入肽链之前都首先被活化和连接在专一tRNA上，活化和连接都发生在氨基酸的羧基上。
（2）载体tRNA凭借自身的反密码子与mRNA上的密码子相识别而把所携带的氨基酸送到肽链的一定位置上
（3）遗传信息是通过mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子间碱基配对作用翻译出来的 。
氨酰tRNA合成酶：
每一种氨基酸都有至少一种专一的氨酰tRNA合成酶，它即能识别氨基酸，又能识别tRNA，从而把特定的氨基酸连到对应的tRNA上，有人也把氨酰tRNA合成酶的双向识别功能称为第二遗传密码。
不同的氨酰tRNA合成酶在分子量、氨基酸序列、亚基组成上差异较大。它是如何识别氨基酸的呢？仍不甚清楚。一些氨基酸由于结构上的显着特征容易识别如大小不同（Trp与Gly），带正负电荷（lys,asp），而一些氨基酸结构极其相似，如Ile 与Val 仅差一个甲基。尽管如此tRNAIle合成酶也能正确识别，但有时也能错误的形成Val –tRNAIle，但是每一种氨酰-tRNA合成酶都有一个校正位点，由于大小原因，只有Val –tRNAIle才能结合到校正位点，然后合成酶将Val又从tRNAIle上将其水解下来。
氨酰-tRNA合成酶还能正确的识别和结合tRNA，对于一些酶来说，tRNA上的反密码子是其识别特征，此外，tRNA上的受体茎环（acceptor stem）也是识别特征。
tRNA分子的突变与校正基因
可以说tRNA是一个万能接头：
（1）对氨酰- tRNA合成酶的识别位点（接头合成酶）
（2）3端-CCA上的氨基酸运载位点（接头氨基酸，装载）
（3）对核糖体的识别位点（将氨基酸运送到目的地）
（4）反密码子位点（接头MRNA，验货并卸载）
同复突变：突变型生物有时重所获得其原有的性状，这是通过突变型遗传物质的化学变化而发生的。这种变化使遗传物质恢复到有功能的状态，重所获得原有的表型，这种过程称为回复，被回复的生物称为回复子。
回复突变的原因很多，其中有一种回复突变是由其在基因上发生一个突变引起的，这称为基因校正突变。大多数较正突变发生在tRNA基因上。
举例：基因间校正突变
图
当有某种tRNA突变分子出现时，必定还有可以识别正常密码子的该种tRNA存在。
二、 蛋白质合成的一般过程
蛋白质合成的一般过程如图18.3，
可以分为三个阶段：起始、延伸、终止，分别由不同的起始因子、延伸因子和终止因子（释放因子）参与。
(一)、 翻译起始
（1）小亚基与mRNA结合
（2）起始氨酰tRNA进入P位点，它的反密码子与mRNA上的起始密码子AUG碱基配对。
（3）大亚基与小亚基结合形成起始复合物。
(二)、 延伸
方向：mRNA 5/ 3/
新生肽： N/ C/
（1）就位：第二个氨酰tRNA通过密码子—反密码子的配对作用进入核糖体的A位点（氨基位点）。
（2）转肽：在大亚基上肽酰转移酶（peptidyl transferase）的作用下，A位点氨基酸的A-氨基亲核攻击P位点氨基酸的羧基基团并形成肽键，结果两个氨基酸均连到了A位点的tRNA上，该过程称为转肽作用（transpeptidation），此时，P位点上卸载的tRNA从核糖体上离开。
（3）移位（translocation，也可称转位）：核糖体沿着mRNA移动1个密码子位置，携带肽链的tRNA转位到P位点，A位点空出以便接纳下一个氨基酸。
(三)、 终止
由于终止密码子不能结合任何氨酰tRNA，于是肽链合成的终止因子（又称释放因子）识别并结合到终止密码子上，接着肽转移酶的酯化酶功能转变成水解功能，将肽链从P位点tRNA上水解掉，核糖体释放掉mRNA并解体成大小亚基，翻译结束。
在翻译过程中除了核糖体大小亚基、 mRNA和氨酰tRNA外，还需要GTP和许多蛋白辅助因子。这些辅助因子有的起催化作用，有的起改变和稳定构象作用。
(四)、 翻译后加工
不论原核生物还是真核生物，翻译完成后，一些肽链能直接折叠成最终的活性形式，不需要加工修饰，然而经常的情况是新生肽链需要加工修饰（称为翻译后加工或修饰）包括：（1）切除部分肽段（蛋白酶）、（2）在特定氨基酸残基的侧链上添加一些基团（共价修饰）、（3）插入辅因子，还有些单肽要聚合成多亚基蛋白。
翻译后加工有两方面目的：
（1）功能需要
（2）定向转运的需要（这在真核生物中尤为复杂，合成的蛋白要定向运输到细胞质、质膜、各种细胞器如叶绿体、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体等）。
尽管原核生物与真核生物在蛋白质合成方面有许多相似之处，但也存在差异，这些差异正是一些抗生素治疗和研究应用的基础。见表18.2

表18.2 蛋白质合成的选择性抗生素抑制剂
抗生素 作用
氯霉素 与50S亚基结合，抑制原核肽转移酶
cycloheximide 抑制真核肽转移酶活性
Erythromycin 抑制原核肽链延伸
链霉素、卡那霉素 结合到原核30S亚基上引起读妈错误，导致合成的多肽连一级结构改变
Tetracycline 与30S亚基结合，干扰氨酰tRNA的结合
三、 原核生物的蛋白质合成
原核生物（大肠杆菌）每秒钟可翻译20个氨基酸，比真核生物快得多，而真核生物每分钟才大约50个氨基酸。
(一)、 翻译起始
（图18.5）
翻译是从形成起始复合物开始的，在原核生物中该过程需要三个起始因子参与：IF1，IF2，和IF3。（IF1的功能尚不清楚）。
（1）IF3首先结合在30S亚基上，防止它过早地与50S亚基结合。
（2）mRNA结合到30S亚基上。
原核mRNA上在距起始密码子上游约10bp处有一段很短的（约10bp）富含嘌呤的区域称为SD序列，它能与30S亚基上的16S rRNA 3端的一段互补序列（不妨称反SD序列）配对结合，mRNA正是通过其SD序列与16S rRNA的配对结合而使它处于核糖体上的恰当的位置，并使起始密码子AUG处于P位点。SD序列与16S rRNA的配对还为识别起始密码子和Met密码子提供了一种机制。
原核多顺反子mRNA上的每一个基因都有自己的SD序列、起始密码子和终止密码子，每一个基因的翻译都是相对独立的。
（3）IF2 、fMet-tRNAfmet结合到30S亚基上
IF2是一个GTP结合蛋白，它先与30S亚基结合并促使起始氨酰tRNA的密码子与mRNA 上的AUG结合（P位点）。原核生物的起始氨酰tRNA是N—甲酰甲硫氨酰tRNA（fMet-tRNAfmet ）。
（4）50S大亚基结合到30S小亚基上，形成起始复合物。
GTP水解成GDP释放的能量引起30S亚基构象变化，50S亚基结合到30S亚基上，同时IF2和IF3释放。
因此，原核生物肽链合成的起始复合体由mRNA、70S核糖体、fMet-tRNAfMet组成。
(二)、 延伸
肽链延伸分三步进行：（1）新的氨酰tRNA进入核糖体的A位点；（2）肽键形成（转肽）；（3）核糖体移位（转位）。这三步构成了肽链延伸的一个循环。
1、 新氨酰tRNA入位
图18.6
首先，在进入A位点之前，新氨酰tRNA必须与延伸因子EF—TU—GTP结合。延伸因子EF—TU是一个GTP结合蛋白，参与氨酰RNA的就位。氨酰RNA就位后，EF—TU—GTP水解，EF—TU—GDP从核糖体上释放下来，在第二个延伸因子EF—Ts帮助下EF—Tu—GDP释放掉GDP并重新结合一分子GTP再生成EF—Tu—GTP。
2、 肽键形成（转肽）
肽键是在肽酰转移酶催化下形成的，现在认为肽酰转移酶活性存在于50S亚基23S rRNA上。驱动肽键形成的能量由P位点上的氨基酸与它的tRNA的高能肽酰酯键提供。新肽键形成后P位点卸载的tRNA就离开核糖体。
3、 核糖体移位。
移位需要另一个GTP结合蛋白EF—G（延伸因子G，又叫移位酶）的参与。现在认为，GTP水解成GDP时释放出的能量促使核糖体构象发生变化，驱动肽酰tRNA从A位点移动到P位点。空下的A位点等待接纳下一个氨酰tRNA 。
EF—Tu：机动蛋白（motor protein）
多亚基的复合体（如核糖体）就象一个生化机器。它由几个相互作用的工作部件组成。机械性的工作是力与距离的产物。每一个生化机器的设计都能非常准确地保证所施用的力的量、所产生运动的量与方向，最后完成一项特定的工作。其中的力通常由核苷酸结合蛋白提供，称为NTPae，实质上是机动蛋白（motor protein，或称机械化学转换器 mechanochemical transcers ）因为NTP（ATP和GTP）的水解所造成的它自身构象的变化驱动了相连分子的构象向所需的方向转变。这种NTP水解驱动的构象变化主要定位于一个固定化的结构单元（称为开关）。EF—Tu就是一个广泛研究的GTP结合机动蛋白。
EF—Tu有三个结构域（ domain），域1含有一个GTP结合位点和二个开关区，域2通过一个柔软的肽段与域1相连。在结合GTP的活性状态下（ EF-Tu-GTP），EF-TU有一个aa-tRNA结合位点。aa–tRNA与 EF-Tu-GTP结合后的整个结构称为三元复合体。
EF-Tu的三个域都参与tRNA的结合。域3的几个氨基酸残基与tRNA的TφC环相互作用。aa-tRNA的反密码子从三元复合物上突出来，以便与mRNA的密码子相互作用。
在蛋白质合成时，EF-Tu-GDP（非活性状态）与EF-Ts相互作用释放出GDP，随后域1的GTP结合位点结合一分子GTP并改变域1的两个开关区的构象，结果使域1与域2靠近，形成1个aa－tRNA结合缝（binding cleft）。一旦一个aa–tRNA结合到该裂缝中，?

参考资料：我老师上课的课件。

㈨ 如何从一些有抗生素抗性基因的微生物中筛选出无抗性基因的突变体

这个可以需要做大规模的筛选。
利用无抗性的固体培养基，挑取单克隆，再划线到有抗性的固体培养基中，没有生长的就可以提取DNA，送去测序确认了。
望采纳，谢谢