尿蛋白pcr演算法

Ⅰ 南京軍區總醫院目前的腎科權威專家主要有哪些其專業特長和專家門診時間是什麼

黎磊石，必須的。

Ⅱ 電泳技術在生物分離工程中的地位

早期的電泳技術是由瑞典Uppsala大學物理化學系Svedberg教授提出了荷電的膠體顆粒在電場中移動的現象稱其為電泳。於1937年，收ArneTiselius教授——諾貝爾獎金獲得者，利用些電泳現象，發明了最早期的界面電泳，用於蛋白質分離的研究，開創了電滬泳技術的新紀元。此後，各種電泳技術及儀器相繼問世，先進的電泳儀和電泳技術的不斷發展，使它在生物化學實驗技術中占重要地位，按電泳的原理有三種形式的電泳分離系統：原則上按電泳的原理來分，即移動界面電泳、區帶電泳和穩態電泳或稱置換（排代）電泳。在自由移動界面電泳，是帶電分子的移動速率通過觀察界面的移動來測定，該方法已成為歷史。代之以採用支持介質的區帶電泳。

區帶電泳因所用支持體的種類、粒度大小和電泳方式等不同，其臨床應用的價值也各有差異。固體支持介質可分為兩類：一類是濾紙、醋酸纖維素薄膜、硅膠、礬土、纖維素等；另一類是澱粉、瓊脂糖和聚丙烯醯胺凝膠。由於它們具微細的多孔網狀結構，故除能產生電泳作用外，還有分子篩效應，小分子會比大分子跑得快而使解析度提高。它的最大優點是幾乎不吸附蛋白質，因此電泳無拖尾的現象。低濃度的瓊脂糖電泳相當於自由界面電泳，蛋白質在電場中可自由穿透，陰力小，分離清晰，透明度高，能透過200～7000nm波長的著色區帶的檢測敏感性，為此第一類支持介質現已被第二類支持介質所替代。

穩太電泳或稱置換電泳的特點是分子顆粒的電泳遷移在一定時間後達到穩態，如等電聚焦和等速電泳。

區帶電泳是臨床檢驗領域中應用最廣泛的技術，有重要臨床意義，尤其是其他新技術，更擴大了其應用范圍，提高了檢測技術，現對該技術的現狀與發展作一評述。

一、正確解釋電泳結果，有助於臨床疾病判斷的參考

新鮮血清經電泳後可精確地描繪出患者蛋白質的全貌，一般常見的是白蛋白降低、某個球蛋白區域升高，提示不同的臨床意義。如急性炎症時，可見a1，a2區百分率升高；腎病綜合征、慢性腎小球腎炎時呈現白蛋白下降，a2球蛋白升高，β球蛋白也升高；缺鐵性貧血時可由於轉鐵蛋白的升高而呈現β區帶增高，醫|學教育網搜集整理而慢性肝病或肝硬變呈現白蛋白顯著降低，r球蛋白升高2-3倍，示免疫球蛋白多克隆增高，甚至可見β-r融合的橋連現象，還可在r區呈現細而密的寡克隆區帶；對單一克隆漿細胞異常增殖所產生的無抗體活性均一的免疫球蛋白稱M蛋白的檢測，血清蛋白電泳是其首選的實驗診斷方法。可在電泳區帶的a2-r區呈現緻密而深染，高度集中的蛋白克隆增生區帶，稱其為m蛋白區帶，掃描後形成高而狹窄的單株峰，若些峰在r區其峰高與峰底寬之比>2：1，而由於正常免疫球蛋白合成限製造成背景染色淺。由M蛋白所導致的一組疾病如：多發性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重鏈病、游離輕鏈病、半分子病、良性單株丙球血症和雙M蛋白血症等，目前這類疾病已不屬罕見。血清蛋白電泳對這類疾病的早期診斷，療效觀察和預後判斷均有十分重要的意義。

二、電泳技術與免疫技術相結合，大大擴大了其臨床應用的范圍

讓電流來加速抗原與抗體的擴散並規定其運行方向、從而加快了沉澱反應速度。免疫電泳技術的種子類很多，如：對流免疫電泳（CIEP）、火箭免疫電泳（RIE）、電免疫擴散（EID）。在種免疫電泳方法牟基礎上，又不斷地派生出一些新的技術，如：免疫電泳（IEP）技術，1969年Alper與Johnson推薦免疫固定電泳（IFE）是一種包括瓊脂糖凝膠蛋白電泳和免疫沉澱兩個過程的操作，是免疫沉澱反應的一種混合技術，檢測標本可以是血清、尿、腦脊液或其他體液。1976年血清免疫固定電泳（IF）技術再次被推薦，用於M蛋白的分型。血清蛋白質在瓊脂糖凝介質上經電泳分離後，應用固定劑和各型免疫球蛋白及輕鏈抗血清，加於凝膠表面的泳道上，經孵育讓固定劑和抗血清的在凝膠內滲透並擴散後，若有對應的原存在，則在適當位置形成抗原抗體復合物。經染色後蛋白質電泳參考泳道和抗原抗體沉澱區帶被氨基黑著色，根據電泳移動距離分離出單克隆組分，可對各類免疫球蛋白及其輕鏈進行分型。該技術的最大優勢是敏感性達50-150mg/dl，操作周期短，僅需數小時，解析度高，結果易於分析。現最常用於M蛋白的分型與鑒定，已列入臨床實驗室的常規檢測工作。

三、電泳技術進行同工酶譜分析，提高診斷率

1、血清乳酸脫氫酶同工酶（iso-LDH）：測定LDH同工酶有電泳法、離子交換柱層析法、免疫法、抑制劑法和酶切法，但迄今用得取多的仍是瓊脂糖凝膠電泳法。經電泳分離後要分離出五種同工酶區帶，急性必肌梗塞發病後平均6hLDH1即開始升高，LDH1/LDH2≥1為心肌損傷的陽性決定性水平，肝癌時可見LDH5明顯升高，各區帶含量的確定，將經電泳分離後的同工酶譜採用掃描予以定量，其精確度明顯高於用肉眼判斷。

2、血清肌酸激酶同工酶（ISO-CK）；測定CK和CH-MB仍是目前用於證實急性心肌梗塞的道選指標。近年來國內一些單位用免疫抑製法測CK=MB，其原理為抗M亞單位的酶活性，因為正常血清中幾乎無CK=BB，故將此值乘以2可以認為大致代表CK-MB的活性。此法簡單迅速，缺點是特異性差，如患者血清中存在CK-BB或者異常CK時，都將出現假性增高。不少作者報道異常CD-同工酶，一條稱巨CK（Maxro-CK），它是CK-BB與免疫球蛋白的復合物，有IgG亦有IgA，在正常血清中Marco-CK僅佔0.8%-1.6%.另一條稱線粒體CK（CK-MT），CK-MT是結合在肌肉、腦、肝內的線粒體表面，可能是線粒體膜的碎片，在正常血清中CK-MT是不出現的，在心梗時亦不出現，只有當組織極度損傷，由於線粒體和細胞壁極度破壞，方可在血清中檢出。由於Macro-CK和不典型的CK-MT均不能被M抗體所抑制，故當它們出現時，會導致CK-MB高於CK總活力的假性升高。使用電泳方法分離CK-MB，是根據CK-同工酶分子結構不同，醫|學教育網搜集整理在電泳緩沖液中，所帶電荷各異，可以從陰極到陽極將CK不同組份予以分離，其分別為CK-MM，CK-MB和CK-BB.電泳特點是當出現異常2同工酶如巨CKⅠ、巨CKⅡ等，從電泳圖譜上很容易發現，由掃描儀對各條酶進行掃描，報告各條區帶所佔百分比，結合總酶活力，求得區帶的酶省略定值結果。Macro-CK在CK-MM和CK-MB中間，而CK-MT位置靠近陰極端，在CK-MM後面。這樣不會將CK-BB和各種異常同工酶誤認為是CK-MB而誤診，也可解決CK-MB假性增高的錯誤原因所在。為此，CK同工酶電泳是項非常實用的檢驗技術，具有十分重要的臨床意義。

3、CK亞型同工酶：此外，CK-MB和CK-MM亞型測定常採用瓊脂糖凝膠等電聚焦電泳或高壓電泳，由於操作比一般電泳麻煩，故常規常測定尚無法普及。目前引進的自動電泳儀，有試劑盒提供，可作CK亞型分析，參考值：CK-MM1（57.7±4.7）%；CK-MM2為（26.5±5.3）；CK-MM3為（15.8±2.5）%；CK-MM3/CK-MM1比值為0.28±0.05（范圍0.15-0.39），陽性決定性水平>0.5.AMI第一天血中以MM3為主，但第二天以後則以MM1為主。採用電泳法分離CKMB，CKMB1和CKMB2在正常人血中CK-MB2極微，一般比值近似是而非，在急性心肌梗塞後4-6hCKMB2亞型即在血循環中可被檢測到，故MB2/MB1的比例明顯升高，並早於總CK-MB片段的增高。當心肌梗塞緩解後此比便也逐漸下降。也可用於溶栓治療後的病情觀察。

四、結合酶免疫標記抗體技術，檢測腦脊液內寡克隆區帶

曾有作者報道採用二維電泳和銀染進行CSF蛋白質的分離與鑒定，方法繁復，耗時，現採用高解析度瓊脂糖凝膠電泳分離CSF中的蛋白質，並經抗原和辣根過氧化物酶標記的特異性IgG抗體進行反應來鑒定「寡克隆區帶」（OCB），經此酶免疫標記放大技術和顯色步驟，蛋白質濃度達31-125ul/L即可予以檢測，可使檢測靈敏度提高了100倍，這樣腦脊液無須濃縮，避免了在濃縮過程中蛋白質的丟失。可用於證實和分辨OCB免疫球蛋白及其型別。若在腦脊液標本中檢出OCB，而其相應標本中未能檢出區帶，則為陽性，真實地反映是由中樞神經系統本身合成的免疫球蛋白，具有重要臨床意義。它是一種定性檢測，在多發性硬化症時，OCB是一個十分重要的標志物。但須將患者血清和CSF在同一天同步進行分析，以認證不同來源的免疫球蛋白。中樞合成免疫球蛋白是中樞神經系統疾患的一個重要信號，主要用於診斷的鑒別診斷中樞神經系統疾患如：多發性硬化症、痴呆、脊髓炎、付腫瘤性腦炎、神經性梅素等。

五、利用固相內抗原、抗體反應分離脂蛋白（a），用於心、腦知管獨立的危險因子的檢測

該技術是利用抗原、抗體反應將電泳分離的脂蛋白予以鑒別。血清經瓊脂糖凝膠電泳，再經染色後可出現不同脂蛋白的條帶。由於凝膠中脂蛋白等電點不同，不僅可區分a、前β和β區帶，又因介質中含有抗脂蛋白（a）【LP（a）】抗體及陽離子存在，抗LP（a）與患者血清中LP（a）結合形成復合物，陽離子則抑制其他脂蛋白的泳動速度，LP（a）便與其他脂蛋白分離開來，使分辨十分清晰的LP（a）條帶呈現在前β與γ區域之間，將陽性條帶掃描後，可獲得區帶的面積及其百分含量，該方法使電泳技術趨於完美，大大減少了手工操作的弊端，既可予以半定量，又能將膠片保存，便於比較。提高對心、腦血管獨立的危險因子——LP（a）檢測的敏感性和特異性。

六、按分子量大小進行非濃縮尿蛋白電泳，區分尿蛋白類型

尿蛋白電泳可將尿液中各種蛋白質分離用於區分尿蛋白類型，可在無操作的情況下，協助臨床判斷腎臟損傷的部位。國內部分實驗室採用SDS-PAGE盤狀電泳進行尿蛋白分離，該法具有局限性，耗時，操作繁瑣，標本要求高，尿液需預濃縮，不適於臨床實驗室廣泛開展。SDS=AGE電泳不需預濃縮，尿蛋白電泳後呈現出中、高分子量蛋白區，帶主要反應腎小球病變；呈現出低分子量蛋白區帶，可見於腎小管病變及溢出性蛋白尿；混合性蛋白尿則可見到大、中、小各種分子量區帶，示腎小球及腎小管均受累及。掃描儀可對電泳後尿液中蛋白質剖象進行掃描，求出百分比，以顯示腎小球或腎小管損傷程度，其電泳圖譜及掃描圖形可作國資料永載，利於分析比較。醫|學教育網搜集整理該技術的最大進步是尿液不需預濃縮，操作簡便，結果清晰，僅需三小時即可完成試驗，還備有完整的定性標准，易於量化，便於分析，對腎臟疾的診斷，鑒別診斷，指導治療和判斷癒合頗有價值。

近期發展起來的毛細管電泳是一種新型的區帶電泳，又稱毛細管帶電泳。它是在毛細管中裝入緩沖液，在其一端注入樣品，在毛細管兩端加直流高電壓實現對樣品的分離，他離後的樣品依次通過設在毛細管一端的檢測器檢出。毛細管電泳在檢驗醫學中的應用也十分廣泛，從所檢測樣品的來源看可分為尿樣、血漿、血清、腦脊液、紅細胞、其他體液或組織，以及實驗動物活體等。從分離對象看包括蛋白質、多肽、氨基酸、糖、酶、DNA、寡核苷酸、病毒、小和生物活性分子、離子、葯物及其代謝產物等。根據用途可分為臨床疾病診斷、臨床蛋白質分析、臨床葯物分析、代謝研究、病理研究、同工酶分析、PCR產物分析、DNA片段及序列分析等。由於它具有無法比擬的高效和快速性，因而受到越來越多科學家們的重視。

中國的電泳技術起步不算太晚，但由於種種原因，大多數實驗室仍採用較落後的電泳設備。隨著國際、國內科技發展的日新月異和檢驗醫學發展的突飛猛進，電泳技術也在不斷發展和更新，其在臨床醫學和分子生物學領域中有著極其廣泛的應用價值，相信隨著該技術的不斷發展必將越來越受到同道們的青睞。

Ⅲ 如何治療糖尿病

糖尿病是一種慢性病,它是由於身體中胰島素分泌不足或胰腺功能完全喪失以及不能適當地利用胰島素所致。它的特徵表現為血液中葡萄糖的濃度異常升高及尿中有尿糖。 預防 良好的生活方式對於糖尿病的預防非常關鍵,應該注意以下4 個要點: 1. 了解糖尿病的知識,從而了解更多的防治措施。 2. 要少吃一點,就是讓攝取的總熱量少一點,不但主食要少吃,而且副食,特別是高熱量的副食也要少吃。 3. 要經常保持一定的運動量。這樣控制了飲食,再加上增強了鍛煉,體重就不至於過胖。4. 心理調節。一個好的心態對糖尿病的預防也是有其積極作用的。因為吃得多、鍛煉少容易引起血糖升高,各種心理不平衡會進一步加強胰島素抵抗,促使糖尿病的發生。 症狀 糖尿病的典型症狀為「多尿、多飲、多食和消瘦」,簡稱「三多一少」。其含義為:排尿次數和尿量增加,常有口渴、口乾而飲水量增加,有飢餓感而飯量明顯增加,與之伴隨的是體重的明顯減輕。但是,有50 %以上的Ⅱ型糖尿病患者患病初期無任何明顯的症狀。此外,糖尿病還有一些不典型症狀需要給予注意,如:乏力、反復感染、傷口不易癒合、皮膚瘙癢、四肢皮膚感覺異常、視力下降、性功能障礙等。 診斷標准及分型 空腹尿糖陽性是診斷的重要線索,空腹血糖≥7. 0mmol/ L ,餐後2 小時血糖或隨機血糖≥11. 1mmol/ L 可診斷為糖尿病,再結合臨床症狀作出最終診斷。 有三種基本的糖尿病類型,它們分別為Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、妊娠期糖尿病。Ⅰ型糖尿病:病人體內只能產生少量或者不能產生胰島素。本型可以發生於任何年齡,且在兒童和青年人中更多發生。在中國糖尿病人中,此型僅佔一小部分。這類糖尿病患者必須用胰島素治療,又稱胰島素依賴型糖尿病。 Ⅱ型糖尿病約占我國糖尿病患者的95 %。又稱為成年發病型糖尿病。此型糖尿病患者均不能分泌足量的胰島素以供身體之需,或者是產生的胰島素不能有效發揮作用,從而導致了血糖的升高,久而久之,還會出現一系列並發症,如眼睛、腎臟、心臟和大血管病變等。 妊娠期糖尿病是指婦女妊娠懷孕期間患上糖尿病。臨床數據顯示大約有2 % - 3 %的女性在懷孕期間可發生糖尿病,有近35 %妊娠期發生糖尿病的婦女可能發展成為Ⅱ型糖尿病。 治療及用葯 一、非葯物療法飲食控制是治療糖尿病的基礎,可以根據標准體重計算每日所需熱量,再計算出每日應攝入的碳水化合物、蛋白質和脂肪的比例。飲食中可加入大量纖維素。1. 平衡膳食,以達到足夠的營養。 2. 避免高糖食物,如各種糖果、甜食。 3. 減少脂肪的攝入,除限制動物脂肪外,每日食用烹調油在20 克以下。 4. 避免油膩和含脂肪高的食物,如油炸食品及瓜子、花生等。 5. 避免含膽固醇高的食品,如動物內臟。 6. 選擇高纖維食物,如粗糧、含纖維高的蔬菜。 7. 定時定量進餐,可以少量多餐。 8. 保證蛋白質的攝入,每公斤體重攝入蛋白質1. 2 克,但不要過多。 9. 多飲水。 10. 在血糖控制好的情況下,可以在兩餐中間吃少量水果,並且減少相應主食攝入量。運動控製糖尿病至關重要,可以嘗試以下幾點: 1. 勤做操。科學家指出,即使斷斷續續做做保健操也能控製糖尿病的發展。要正確選擇做操的時間:飯後2 個小時,血液里糖分增加,這時做操有助於血液里糖分保持平衡。 2. 慢步小跑對心臟和血管有利。所以,每天半小時快步走或慢跑步,能同時防治兩種疾病:心肌硬死和糖尿病。 3. 減去多餘的重量。減肥有助控製糖尿病。減肥3 公斤就能大大降低血液里糖的含量。 二、葯物療法 西葯非處方葯 Ⅰ型糖尿病者應當使用胰島素注射液,胰島素分短效及長效三種,根據病情在醫生指導下使用。 Ⅱ型糖尿病患者必須長期服用降糖葯物,常用的有兩大類,即磺醯脲類(甲苯磺丁脲、優降糖、美吡達、達美康、糖適平) 與雙胍類(降糖片、降糖靈) 。 中成葯 糖尿病患者可以根據中醫辨證選用中成葯輔助治療。 常使用的葯品有參芪降糖片、金芪降糖片、益津降糖口服液、降糖丸、消渴丸等。還有卓奇諾膠囊可以清熱、除濕、滋陰等作用,適用於消渴症。另外露水草膠囊也具有滋陰清熱。 三、用葯須知 1. 葯物治療取決於病型、病情、年齡及肝腎功能,尚無固定的治療模式。患者必須在醫院確診後在醫師指導下,對症使用各類葯物。 2. Ⅰ型糖尿病在飲食控制和運動療法的基礎上可用胰島素終身治療; Ⅱ型糖尿病在非葯物治療不能控制血糖時應開始葯物治療。 3. Ⅱ型糖尿病大多服用降糖葯,先選一種,調整適合劑量,療效不滿意時可加用雙胍類或磺脲類和胰島素,可能將空腹及餐後血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c) 控制在接近正常范圍內,以延緩糖尿病並發症的發生和進展。

Ⅳ 尿pcr是什麼意思

尿總蛋白與肌酐比值

Ⅳ 出現蛋白尿，除了是腎臟病，還有可能是什麼

▲腎單位的解剖結構

02

看看你屬於哪種蛋白尿類型？

總體而言大概可分為三類：

一過性蛋白尿

直立性蛋白尿

持續性蛋白尿

一過性蛋白尿：會短暫性間歇出現，是目前最常見的蛋白尿類型，可出現在發熱感染或劇烈運動之後，通常不需要治療。前面說的小夥子，就是這個類型，跟他說清楚之後，心裡的大石頭就落了下來。

直立性蛋白尿：特點是直立位時尿蛋白排泄增加，而平躺卧位時沒有蛋白尿，多見於青少年，一般＞30歲的成年人不常見。直立性蛋白尿對身體基本上沒有什麼害處，一般也不需要治療，另外蛋白尿的情況，通常隨著年齡的增長而消失。

持續性蛋白尿：與一過性和直立性蛋白尿相比，具有潛在腎臟疾病風險。需要重點排查：腎臟疾病、糖尿病、高血壓、狼瘡等繼發性疾病。

03

蛋白尿引起什麼症狀？

少量蛋白尿者一般沒啥感覺和表現。然而，如果大量的蛋白尿，會出現水腫。水腫的特點：早上起床後發現面部，特別是眼皮水腫，下午出現雙下肢的水腫，嚴重的會全身水腫。

還有就是不得不提的「泡沫尿」，這里必須說明的是正常的尿液，尿到馬桶里也會出現一定量的泡沫，不一定就是蛋白尿，而真正的蛋白尿泡沫細小，不容易消散，尿上去的感覺像棉花糖，有種軟綿綿的感覺。如果你還是區分不了，也不用糾結，請看下文如何診斷。

04

蛋白尿的診斷

蛋白尿通常行尿常規檢查就可以明確，具體是提示蛋白幾個加號，如果不放心，建議非同一天多測幾次小便，看看自己到底有沒有蛋白尿。

畢竟尿常規的蛋白是一種定性，如果兩個或兩個以上加號，建議做24小時尿蛋白定量，看看蛋白尿一天到底有多少。不方便的時候也可以測隨機尿，做一個尿PCR（尿蛋白/尿肌酐）。

如果持續性蛋白尿診斷明確，醫生肯能會讓你繼續抽血化驗肝腎功能等指標，重點關注白蛋白及尿素氮和肌酐，明確有沒有低蛋白血症和腎功能不全。大量蛋白尿，有時候醫生會建議行腎穿刺活檢術，而明確腎臟病變的類型以指導治療。

05

蛋白尿的治療

一過性和直立性蛋白尿一般不會引起長期的健康問題，通常不需要治療。

持續性低蛋白尿，醫生一般會使用降壓葯物，如血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）或血管緊張素II受體阻滯劑(ARB)，以減少或消除蛋白尿,或者具體根據腎穿刺病理類型，選用激素及免疫抑制劑來治療。

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Ⅵ pcr的關鍵性技術

一般為48h以內，有些最好於當日電泳檢測，大於48h後帶型不規則甚致消失。
假陰性，不出現擴增條帶
PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配製有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變：通常進行PCR擴增採用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 後，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

假陽性
出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。
靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補後，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現非特異性擴增帶
PCR擴增後出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數 過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶 則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次 數。適當提高退火溫度或採用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

出現片狀拖帶或塗抹帶
PCR擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由於酶量過多或酶的質量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環次數。

克隆PCR產物
1)克隆PCR產物的最優條件是什麼？
最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求，為提高連接效率，需4℃過夜。

2)PCR產物是否需要用凝膠純化？
如凝膠分析擴增產物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什麼對照實驗？
A）塗布未轉化的感受態細胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上帶有氨苄抗型的質粒，或產生氨苄抗型的菌落。
B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。
例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用於100ul感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul後，用100ul鋪板。培養過夜，產生1000個菌落。轉化率為： 產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。
鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u後含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：
1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態細胞
如沒有菌落或少有菌落，感受態細胞的轉化率太低。
C）如用pGEM-T正對照，或PCR產物，產生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質量標准好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應為白斑，如產生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。

4)對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什麼問題？
A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數克隆，為提高效率，需4℃過夜。
B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新制備。如產生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
C）插入片段不適於連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發生。UV過度照射會產生嘧啶二聚體，不利於連接，DNA必需重新純化。
D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A，後者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）。
E）高度重復序列可能會不穩定，在擴增中產生缺失和重排，如發現插入片段高頻率地產生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞

PCR反應體系與反應條件
標準的PCR反應體系：
10×擴增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul

PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決於引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設計引物應遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，以避免因末端鹼基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列資料庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

酶及其濃度目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

dNTP的質量與濃度dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度後，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配製)，如其中任何一種濃度不同於其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。

模板(靶基因)核酸模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常採用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，並解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉澱； 蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉澱核酸。提取的核酸即可作為模板用於PCR反應。一般臨床檢測標本，可採用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用於PCR擴增。RNA模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+濃度Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。

PCR反應條件的選擇
PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。
溫度與時間的設置： 基於PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標准反應中採用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火並結合到靶序列上，然後快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對於較短靶基因(長度為100～300bp時)可採用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般採用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。
①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低於93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。
②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性後溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由於模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對於20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。
③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高於90℃時， DNA合成幾乎不能進行。
PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利於引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。
1.PCR反應的最適條件
4．1 TaqDNA聚合酶
在早期進行的PCR反應中，使用的是大腸桿菌DNA聚合酶1的大片段，，即Klenow片段。也曾有人用噬菌體T4 DNA聚合酶。這兩種酶的共同弱點是對熱不穩定性，DNA合成反應只能在370C進行。PCR時每一循環的解鏈溫度都在90C以上進行，故在每兩個循環之間要加入新的DNA聚合酶，使得整過程整個實驗過程很繁瑣和昂貴。同時在370C，引物與DNA模板之間會發生分子非特異性結合，最終導致很多非特異性DNA片段的擴增。
Taq 酶有耐高溫的特性，其最適的活性溫度是720C（75-80），連續保溫30分鍾仍具有相當的活性，而且在比較寬的溫度范圍內都保持著催化DNA合成的能力，一次加酶即可滿足PCR操作過程自動化的實現。
（1） TaqDNA聚合酶的熱穩定性及最適延伸溫度
相對分子質量為94000的TaqDNA聚合酶的酶活性較高，大約為200000Umg，在合成時有一個較高的最適溫度75-80C，轉換數Kcat接近150nt/(s•酶分子)。這種活性有明顯的溫度依賴性。TaqDNA聚合酶雖然在90C以上合成DNA的能力有限，但高溫時仍比較穩定。有人試驗證明在92.5C,95C,和97.5C時，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分別經130分鍾、40分鍾和5-6分鍾後仍可保持50%左右的活性，其半衰期較長。所以，在一個PCR預備試驗中，每次循環時上限溫度為95C（試管內）處理20秒，則循環50次後TaqDNA聚合酶仍可保持65%的活性，能夠保證實驗的需要。
TaqDNA聚合酶具有很高的加工合成特性，其最適延伸溫度在75-80C時，dNTP的摻入速度為35-100nt/(•酶分子),最長延伸長度7。6kb，如對M13上的富含GC的30-me引物，該酶在70C的延伸率高於60nt/(•酶分子), 在55C仍有較高的延伸活性，22C和37C時延伸速度分別為0。25和1。5 nt/(•酶分子)。由此可見，在低溫下，TaqDNA聚合酶一表現活性明顯降低，因而，導致此酶在模板鏈分子內局部二級結構區域的延伸能力受損或前進速率常數與解離常數的比值發生改變。在很高的溫度（90C以上）時，很少DNA合成。在體外條件下，DNA在較高溫度時的合成速度受到引物或引物鏈與模板鏈的雙鏈結構穩定性的限制。溫度對TaqDNA聚合酶活性的影響見表。
由於TaqDNA聚合酶的最適延伸溫度高達75-80C，故退火和延伸反應溫度均可提高，限制了非特異性擴增產物的出現，增加了PCR的特異性。

4．2 模板
（1） 模板的純度 一般不要求很高，不需要達到超純。某些擴增實驗中甚至可以直接將溶細胞液煮沸加熱，用蛋白質變性後的DNA溶液作模板。但DNA溶液中不能有影響擴增反應的物質存在，例如蛋白酶、核酸酶、結合DNA的蛋白質等；另一類是尿素、十二烷基硫酸鈉、卟啉類物質等；還有一類是二價金屬離子的絡合劑（如EDTA）等，會與Mg2+絡合，影響Taq DNA聚合酶的活性。上述物質的存在會影響擴增效果，甚至使擴增失敗。
（2） 模板DNA的量 一般對於單拷貝的哺乳動物基因組模板來說，100ul的反應體系中有100ng的模板已足夠。有時，加的模板太多，會令擴增失敗。這時如果對模板稀釋後再加入反應體系中，往往能獲得成功。
4．3 dNTP
dNTP儲備液必須為PH7.0左右,濃度一般為2mmol/L, 分裝後置-20C保存.典型的PCR擴增體系中,兩種dNTP的終濃度為20-200umol/L. 理論上,100ul反應液中兩種dNTP的濃度為20umol/L時,足以合成12.5ug DNA或合成10pmol 400bp的DNA片段. DNTP會絡合溶液中的 Mg2+, 而且大於200umol/L的dNTP會增加Taq DNA聚合酶的錯配率.如果dNTP的濃度達到1mmol/L時,則會抑制Taq DNA聚合酶活性.
4．4 Mg2+濃度
Taq DNA聚合酶在合成新DNA鏈時,要求有游離的Mg2+,因而在PCR系統中確定Mg2+的最適濃度是必要的. Mg2+濃度太低會無PCR產物,太高又會導致非特異的產物產生. 故常需根據各自的實驗預先試驗,以確定本實驗的最佳Mg2+濃度,保證DNA聚合酶具有良好的活性.
通常情況下,要求反應體系中有0.5-2.5mmol/L的游離Mg2+.反應內容物中, dNTP能與Mg2+.結合,所含EDTA會與Mg2+絡合,高濃度的DNA也有干擾作用,都會影響Mg2+的有效濃度.
4．5 PCR系統中的其它成分
PCR反應緩沖溶液通常用10 mmol/L Tris-HCl(PH8.3, 20C), 它是兩性離子緩沖劑.此外,還有50 mmol/L KCL, 它有利於引物與模板退火.高於50mmol/L 的KCL, 或50mmol/L 的NaCl對Taq DNA聚合酶有抵製作用.明膠或血清白蛋白(100ug/ml)及非離子去污劑,如Tween20等,對Taq DNA聚合酶起穩定作用.
4．6 PCR的熱循環計劃
在標准反應中,將標本加熱至90-95C,使DNA雙鏈變性, 再快速冷卻至40-60C使引物退火並結合到互補靶序列上,然後升溫至70-75C, 在Taq DNA聚合酶的作用下摻入單核苷酸使引物沿模板延伸.每步時間從反應達到要求溫度後計算. PCR反應的每一個溫度循環周期都是由DNA變性引物退火和反應延伸3個步驟組成的.圖中設定的反應參數是94C變性1分鍾,60C退火1分鍾,72C延伸1.5分鍾.如此周而復始,重復進行,直到擴增產物的數量滿足實驗需求為止.
(1) 變性溫度與時間 使靶基因模板和PCR產物完全變性是PCR成敗的關鍵.DNA在其鏈分解溫度時的變性只需幾秒鍾,但反應管內達到Tss還需一定時間,變性溫度太高會影響酶活性;通常情況下94-95C變性1分鍾就足以使模板DNA完全變性,更高的溫度可能更為有效(尤其是富含C+G的靶基因),若低於94C,則需延長變性時間.為提高起始模板的變性效果,保存酶活性,常常在加入Taq 酶之前97C先變性7-10分鍾,再按94C的變性溫度進入循環方式,這對PCR的成功有益處.
(2) 復性溫度與時間 復性溫度決定著PCR的特異性.引物復性所需的溫度與時間取決於引物的鹼基組成、長度和濃度。合適的復性溫度應低於擴增引物在PCR條件下真實Tm值的5C，引物越短（12-15bp）,復性溫度越低（40-45C）。一般來說，若降低復性溫度（37C），可提高墳增產量，但引物與模板間錯配現象會增多，導致非特異性擴增上升；若提高復性溫度（56-70C），雖擴增反應的特異性增加，但擴增效果下降。理想的方法是：設置一系列對照反應，以確定擴增反應的最適復性溫度。
（3）延伸溫度與時間 Taq DNA聚合酶雖能在較寬的溫度范圍內催化DNA的合成，但不合適的溫度仍可對擴增產物的特異性、產量造成影響。引物延伸溫度一般為72C（較復性溫度高10C左右），延伸時間視目標DNA片段長短和濃度而定。在最適溫度下，核苷酸的摻入率為35-100nt/s，這也取決於緩沖體系、PH值、鹽濃度和DNA模板的性質等，延伸1分鍾對長達2kb的擴增片段是足夠的，延伸時間過長會導致非特異擴增帶的出現，但在循環的最後一步延伸時，為使反應完全，提高產量，可將延伸時間延長4-10分鍾。
（4）循環數 循環數決定著擴增程度，常規PCR一般為25-40周期，在其他參數交已優化的條件下，最適循環數取決於靶序列的初始濃度，其相應關系參照下表
模板DNA分子數 需要熱循環次數
3．0×105 25-30
1．5×104 30-35
1．0×103 35-40
50 40-45
循環次數太少，得不到一定的產物量；循環次數太多時，擴增反應的後期，產物積累的指數率下降甚至不再有正確的產物生成，正常的反應幾乎停止，呈現平台效應。
影響出現平台效應的因素有：
A、反應試劑（dNTP或酶）穩定性的改變；
B、終產物（如焦磷酸）的抑制效應；
C、產物濃度超過10-5時可產生重復退火，於是會降低引物延伸速率或DNA聚合酶的活性
D、高濃度產物DNA雙鏈的解鏈不寶劍。平台效應時的一種重要後果是由於錯誤引導，在開始時濃度不高的非特異產物會繼續擴增，使結果的分析復雜化。
4．3引物的要求：
（1） 一般長15-30bp，常用20bp（理論上420=11×1011長的DNA片段才會有重復）。引物過長，擴增的效率降低。
（2） 鹼基組成：C+G佔50-60%（常規），盡量避免數個嘌呤和嘧啶的連續排列。
（3） 一對引物之間不能有2個以上的鹼基互補，特別是3『末端；引物之間的鹼基互補會形成引物二聚體，引物本身應避免迴文序列。
（4） 引物與模板退火的溫度和所需的時間取決於引物的鹼基組成、長度和溶液中引物的濃度。合適的退火溫度是低於引物本身的實際變性溫度（Tm）50C。20bp左右長度的DNA片段的Tm=(G+C) ×40C+(A+T) ×20C。退火火溫度通常在55-720C下進行在標準的引物濃度（0.2umol/L）下，幾秒內即可完成退火。提高退火溫度可提高引物與模板結合的特異性。特別在最初幾次循環中採用嚴謹的退火溫度，有助於PCR特異性擴增。如果引物中（G+C）的含量小於50%，退火溫度應低於550C。
（5） 100ul的PCR反應液中，引物的絕對量為10-100pmol。PCR反應液中2個引物濃度不等時，其濃度比為50:1，稱為不對稱PCR。
簡並引物：由多種寡核苷酸組成的混合物，彼此之間僅有一個或數個核苷酸的差異。若PCR擴增引物的核苷酸組成順序是根據氨基酸順序推測而來，就需合成簡並引物。
嵌套引物：利用第一輪PCR擴增產物作為第二輪PCR擴增的起始材料，同時除使用第一輪的一對特異引物外，另加1-2個新引物（處在同一個模板DNA的頭兩個引物之間序列）進行第二輪擴增。通過嵌套引物擴增的產物，產生錯誤擴增的可能性極小，所以應用嵌套引物技術能夠使靶DNA序列得到有效的選擇性擴增。
PCR的的應用：基因克隆、反向PCR、不對稱PCR、RT-PCR、基因的體外誘變和突變檢測、基因組的比較研究

Ⅶ 請高醫詳解--前列腺常規和尿液常規化驗單

尿液常規檢查包括一般性狀檢查，化學檢查和顯微鏡檢查三個方面。
怎樣看尿液常規報告單加入時間：2009-03-18 編輯：wangman 來源：深圳醫療網 尿液常規分析是我們經常做的一項檢查。大多數醫院都用尿液分析儀檢測，檢測項目目前有10項、11項或12項，並且報告的格式不統一，既有「+」(陽性)、「-」(陰性)，又有數字，檢驗項目的單位也不一樣。到底該怎麼閱讀尿檢報告呢?
尿常規項目大致可分為四大類：腎病類、糖尿病類、泌尿感染類以及其他疾病類。
腎病類項目
酸鹼度(pH)、比重(SG)、隱血或紅細胞(BLD、ERY)、蛋白質(PRO)和顏色(COL)。正常參考值分別為：4.6～8.0、1.005～1.030，陽性、陰性，淡黃色至深黃色。這些指標的改變可能提示有腎功能損害。
糖尿病類項目
酸鹼度(pH)、蛋白、比重、糖(GLU)和酮體(KET)。這些指標的檢測有助於診斷相關並發症和機體一些器官是否受到損害，如是否出現酮血症等。正常情況下，尿糖和酮體為陰性。
泌尿感染類項目
白細胞(WBC)、隱血或紅細胞、亞硝酸鹽(NIT)、顏色和濁度(TUR)。當泌尿系統受到細菌感染時，尿中往往出現白細胞和紅細胞，尿液顏色或濁度也發生改變，亞硝酸鹽有時也會為陽性。化學檢測尿白細胞和隱血或紅細胞只起過篩作用，臨床診斷以鏡檢結果為准。
其他疾病類項目
主要是酸鹼度、比重、膽紅素(BIL)、尿膽原(URO)、顏色及其他指標。膽紅素和尿膽原兩項指標反映肝臟代謝血紅素的能力和數量。正常情況下，尿膽紅素為陰性，尿膽原為弱陽性。以上指標增高時，往往提示黃疸，尿液顏色呈黃綠色。
尿液常規分析化驗單上一些項目後面出現「+」或「+++」……或數字，表明程度不同，這在醫學上叫陽性結果;相反，「-」就稱陰性結果。在閱讀報告時，要客觀地分析報告，因為有許多干擾因素影響到檢測結果的准確性，如飲食因素、尿液中的一些干擾物等。當尿常規檢查出現異常時，請不要太緊張和太憂慮;同樣，當出現和臨床表現不一致的檢驗結果時，也不要盲目樂觀。一定要配合臨床醫生做進一步的檢查和分析，以免延誤疾病的診斷。
怎樣看懂尿常規檢查報告單?
尿液常規檢查是健康體檢的重要項目，它不僅可反映泌尿系統疾病，對糖尿病、黃疸肝炎、膽道梗阻等多種疾病的篩選也有重要意義。
1.尿蛋白(PR0)
正常尿常規檢查一般無蛋白，或僅有微量。尿蛋白增多並持續出現多見於腎臟疾病。但發熱、劇烈運動、妊娠期也會偶然出現尿蛋白。故尿中有蛋白時需追蹤觀察明確原因。
2.尿糖(GLU)
尿糖陽性要結合臨床分析，可能是糖尿病，也可能是因腎糖閾降低所致的腎性糖尿，應結合血糖檢測及相關檢查結果明確診斷。由於尿中維生素C和阿斯匹林能影響尿糖結果，故查尿糖前24小時要停服維生素C和阿斯匹林。
3.尿紅細胞(RBC)
每個高倍顯微鏡視野下，尿液紅細胞超過5個以上，稱為鏡下血尿;大量紅細胞時，稱「肉眼血尿」，可見於泌尿系統炎症、感染、結石、腫瘤等，應加重視，並立即到泌尿專科進一步檢查，以明確血尿的部位和原因。
4.尿白細胞(WBC)
每個高倍顯微鏡視野下，尿液白細胞超過5個以上，稱白細胞尿，大量白細胞時，稱膿尿，它表示尿路感染，如腎盂腎炎、膀胱炎、尿道炎等。
5.尿上皮細胞(SPC)
尿液中有少量上皮細胞臨床意義不大;大量出現時，如能排除陰道分泌物污染，就要考慮泌尿系統炎症存在。此時，如加做尿上皮細胞形態檢查，可確定上皮細胞的來源。
6.尿管型(KLG)
尿中出現管型，特別是顆粒管型、細胞管型都是腎臟實質性病變的標志。
7.尿潛血(ERY)
正常情況尿潛血試驗陰性。尿潛血陽性同時有蛋白者，首先考慮腎臟疾病和出血性疾病，可進一步做腎功能檢查;如尿蛋白陰性應到有關專科查明出血部位和性質。一般認為，下尿道出血因紅細胞未被破壞，潛血可不明顯。
8.尿膽原(UBG)、尿膽紅素(BIL)
尿膽原和尿膽紅素陽性，多提示有黃疸存在，有助於黃疸的診斷和鑒別診斷。
9.尿亞硝酸鹽(NIT)尿亞硝酸鹽主要用於尿路感染的過篩試驗。新鮮尿時亞硝酸鹽呈陰性，如標本放置時間過久或有細菌生長繁殖可呈假陽性。
為何兩家醫院化驗結果不一樣
有些人總希望通過對多個醫療單位的化驗結果進行綜合判斷，以確定自己是否健康。但是，有時會出現在一家醫院化驗正常，可在另一個醫院卻不正常的情況。那麼，為什麼會出現這種情況呢?原因是多方面的。
首先，也是最常見的原因，是體檢者未仔細閱讀「體檢須知」，留取標本不當，以致使同一個人兩次檢測的標本實際上並不相同。例如，抽血前是否禁食，空腹對測定結果影響很大(如血糖、血脂等);抽血前是否處於安靜狀態，因有些項目，如轉氨酶等在劇烈運動後會升高;留取的尿液是否是晨尿，因清晨第一次尿與平時的隨機尿檢查結果相差較大。
其次，體檢者兩次體檢時的身體狀況不一致。如體檢者是否服用了葯物，有些葯物會影響測定項目(如轉氨酶、肌酐等)，或女性體檢者是否處於月經期等。
另外，也有可能是因為兩家醫院的測定方法不同，使用的儀器不同造成結果有差異。另一種可能就是醫務工作者責任心不強，張冠李戴，弄錯了標本。
如果出現兩家醫院的檢驗結果不一致時，體檢者不必驚慌，可要求醫務人員作出合理的解釋，並在醫務人員的指導下正確留取標本，配合他們找出原因，還自己身體狀況的本來面目。

Ⅷ PCR基因擴增原理

基因擴增技術（PCR）聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction簡稱PCR）又稱無細胞分子克隆系統或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法，是基因擴增技術的一次重大革新。可將極微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力，能檢測單分子DNA或對每10萬個細胞中僅含1個靶DNA分子的樣品，因而此方法立即在分子生物學、微生物學、醫學及遺傳學等多領域廣泛應用和迅速發展。由於PCR具有敏感性高、特異性強、快速、簡便等優點，已在病原微生物學領域中顯示出巨大的應用價值和廣闊的發展前景。
PCR技術是由Cetus公司和加利福尼亞大學1985年聯合創造的，主要貢獻者為Kary B mulis和HeneryA、Erlich。該方法首先被應用於人β-珠蛋白DNA的擴增及鐮刀狀紅細胞貧血病的產前診斷。自85年首次報道PCR方法以來，PCR被廣泛應用於分子克隆、序列分析、基因突變、遺傳病、傳染病、性傳播性疾病及法醫判定和考古研究等多領域、並發揮了越來越大的作用。因而發明人Kary B、mulis獲1993年諾貝爾化學獎。
為了使PCR技術在臨床上迅速得以普及，我們對該技術的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技術變得簡單、微量化、不易發生污染，從而使PCR技術常規化成為可能。我們的方法迅速在全國各大醫院得到推廣。
一、PCR的基本原理和基本程序
PCR擴增DNA的原理是：先將含有所需擴增分析序列的靶DNA雙鏈經熱變性處理解開為兩個寡聚核苷酸單鏈，然後加入一對根據已知DNA序列由人工合成的與所擴增的DNA兩端鄰近序列互補的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴增的DNA片段，一般需20-30個鹼基對，過少則難保持與DNA單鏈的結合。引物與互補DNA結合後，以靶DNA單鏈為模板，經反鏈雜交復性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷（dNTP）為原料按5'到3'方向將引物延伸、自動合成新的DNA鏈、使DNA重新復製成雙鏈。然後又開始第二次循環擴增。引物在反應中不僅起引導作用，而且起著特異性的限制擴增DNA片段范圍大小的作用。新合成的DNA鏈含有引物的互補序列，並又可作為下一輪聚合反應的模板。如此重復上述DNA模板加熱變性雙鏈解開—引物退火復性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環過程，使每次循環延伸的模板又增加1倍，亦即擴增DNA產物增加1倍，經反復循環，使靶DNA片段指數性擴增。
PCR的擴增倍數Y=（1+E）n,這里Y是擴增量，n為PCR的循環次數。E為PCR循環擴增效率。設PCR擴增效率E為100%、循環次數n=25次，靶DNA將擴增到33554432個拷貝，即擴增3355萬倍：若E為80%、n=20、則擴增數量將下降到1408865拷貝，即擴增產物約丟失93%，若E=100%，n=20，則擴增數量減少1048576個拷貝，擴增產物約減少97%。可見PCR循環擴增效率及循環次數都對擴增數量有很大影響。PCR擴增屬於酶促反應，所以，DNA擴增過程遵循酶促動力學原理。靶DNA片段的擴增最初表現為直線上升，隨著靶DNA片段的逐漸積累，當引物—模板/DNA/聚合酶達到一定比值時，酶的促化反應趨於飽和，此時靶DNA產物的濃度不再增加，即出現所謂平台效應。PCR反應達到平台期的時間主要取決於反應開始時樣品中的靶DNA的含量和擴增效率，起始模板量越多到達平台期的時間就越短、擴增效率越高到達平台期的時間也越短。另外酶的含量，dNTp 濃度，非特異性產物的擴增都對到達平台期時間有影響。
二、PCR的特點
（一）特異性高：首次報導的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃會變性失活，需每次PCR循環都要重新加入Klenow大片段，同時引物是在37℃延伸（聚合）易產生模板—引物之間的鹼基錯配、致特異性較差，1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩定的Taq DNA聚合酶，在熱變性處理時不被滅活，不必在每次循環擴增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續反應，顯著地提高PCR產物的特異性，序列分析證明其擴增的DNA序列與原模板DNA一致。擴增過程中，單核苷酸的錯誤參入程度很低、其錯配率一般只有約萬分之一，足可以提供特異性分析，選用各型病毒相對的特異寡核苷酸引物。PCR能一次確定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測病婦宮頸刮片細胞可以發現部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染。
（二）高度敏感：理論上PCR可以按2n倍數擴增DNA十億倍以上，實際應用已證實可以將極微量的靶DNA成百萬倍以上地擴增到足夠檢測分析量的DNA。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞，或對諸如病人口液等只含一個感染細胞的標本或僅含0.01pg的感染細胞的特異性片段樣品中均可檢測。
（三）快速及無放射性：一般在2小時內約可完成30次以上的循環擴增，加上用電泳分析。只需3-4小時便可完成，不用分離提純病毒，DNA粗製品及總RNA均可作為反應起始物，可直接用臨床標本如血液、體液、尿液、洗液、脫落毛發、細胞、活體組織等粗製的DNA的提取液來擴增檢測，省去費時繁雜的提純程序，擴增產物用一般電泳分析即可，不一定用同位素，無放射性易於推廣。
（四）簡便：擴增產物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法，可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因，省去常規方法中須先進行克隆後再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測。如在PCR引物端事先構建一個內切酶位點，擴增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相應酶切位點的載體中。
（五）可擴增RNA或cDNA：先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉錄酶將mRNA轉變成單鏈cDNA，再將得到的單鏈cDNA進行PCR擴增，即使mRNA轉錄片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能經PCR擴增1ng有242鹼基對長度的特異片段，有些外顯子分散在一段很長的DNA中，難以將整段DNA大分子擴增和做序列分析。若以mRNA作模板，則可將外顯子集中，用PCR一次便完成對外顯子的擴增並進行序列分析。

Ⅸ 教你如何讀懂CKD

引言：

慢性腎臟病（CKD）患病率高，醫療花費大，預後差，它是繼心腦血管疾病、糖尿病、腫瘤，又一個嚴重威脅人類健康的疾病。但是，知道和關注CKD的人卻並不多，今天和大家一起學習一下。

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?6.如果有慢性腎臟病，

我該怎麼辦？

如果檢查結果提示有慢性腎臟疾病，您應該找一位靠譜的醫生，重點找一下腎病的原因，因為只有找到原因，治療上才更有把握和有的放矢。同時醫生會評估您的腎功能及全身狀態，來幫助您制定治療計劃。

慢性腎臟病是典型的慢性病，您以後可能要與腎內科醫生經常打交道。明智的做法是選擇一位臨床經驗豐富且態度友好的醫生，更明智的做法是選擇一位您信任的醫生，當然您也要聽醫生的話，往往依從性好的患者，治療效果會更好。（面對生命的層面，世界上恐怕只有醫生不會去害你）

當您面對疾病，您和您的家庭需要做一些生活方式以及思想觀念上的調整。您需要主動配合臨床技術精湛的腎臟健康團隊（包括醫師、健康教育護士和營養師）來幫助您，自己盡可能多地學習有關腎臟病的健康知識，知道自己將會遇到什麼以及可以做些什麼來可以幫到自己。

7.您需要了解，

慢性腎臟病常見檢查項目

建議每年至少2次進行尿常規和腎功能的檢查，了解您的疾病狀態和臨床分期。

常見檢查有：

●尿常規：可以檢查尿液中的許多異常，如血、蛋白質、膿、糖和細菌等。

●尿微量白/肌酐（ACR）：是檢測尿有無蛋白質的敏感方法。

●尿蛋白/肌酐(PCR)：可以估算一天的尿液中蛋白質的排泄量，而不需要收集24小時的尿液標本。

●腎小球濾過率（GFR）：GFR是評價您腎臟功能的最好方法，醫生根據您的血肌酐值、年齡、體重和性別來計算您的GFR，幫助確定您腎臟疾病的階段。

●泌尿系統超聲或CT：幫助您了解腎臟的大小，輸尿管否有梗阻或膀胱腫瘤等。

●腎活檢：在某些情況下需要做，來幫助確定腎臟病的具體類型、腎臟損傷的程度以及確定治療方案。

8.您需要了解，

慢性腎臟疾病的基本治療原則

治療上基本的原則：一是緩解症狀；二是延緩病程進展。

其主要內容包括以下幾方面：

●調整生活方式：包括規律作息、避免勞累、預防感染、合理鍛煉、戒煙戒酒等

●腎病營養治療：包括蛋白質及熱量的攝入、低鹽飲食、其他營養物質的攝入等

●控制蛋白尿和血壓：最關鍵的治療

●控制血糖、尿酸和血脂水平

●慎用腎毒性葯物、中草葯和保健品

●慢性腎臟病並發症的防與治

●終末期腎臟病的替代治療：腹膜透析、血液透析和腎臟移植等

2017年

「醫說就懂」系列科普中，

我們再慢慢展開談。

預祝大家新年快樂！

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Ⅹ 尿常規檢查，尿蛋白2個+ 白細胞85，大概有什麼問題

做下腹部B超檢查腎臟和前列腺，看看是不是有炎症。
尿不盡是尿路感染或者前列腺炎症狀，出現尿蛋白可能與前列腺或者腎臟疾病有關。
建議再做分泌物培養或者PCR，檢查是否有支原體衣原體感染。
還有一個辦法，你可以口服諾氟沙星，每次兩粒，每日三次，服三天如果有效，繼續服用4-7天即可。