抗生素測序演算法

㈠ 16srRNA的測序結果怎麼分析

原核生物的30S核糖體亞基中含有16S rRNA.16S rRNA的相對分子質量約為0.6 MDa,長度約為1540 nt.在30S核糖體亞基組裝過程中,16S rRNA與其核糖體蛋白質S4、S7、S8、S15、S17和S20結合先行成初級復合物.
16S rRNA約有一半的核苷酸形成鏈內鹼基對,使其具有約60個螺旋；分子中未配對部分則形成突環.在濃度足夠的Mg2+存在下分離得到的16S rRNA處於緊密狀態,與30S核糖體亞基的結構相似.已發現16S rRNA中的一些序列與蛋白質合成時30S核糖體亞基、mRNA及一些翻譯因子的結合有關.核糖體16S rRNA的3'端能識別待翻譯mRNA的5'端的夏因-達爾加諾序列,起始翻譯.另有研究表明,16S rRNA也能與進入核糖體P位點的tRNA相互作用.
16S rRNA作為研究分類學和系統進化的分子受到很大重視,16S rRNA序列分析是當前對細菌進行分類學研究中較精確的一種技術.隨著分子生物學的快速發展以及該技術在醫學微生物研究中的應用,對16S rRNA作為微生物分類依據的研究也逐漸發展起來並已得到廣泛認同.
位於原核生物70S核糖體A位點的16S rRNA部分的是氨基糖苷類抗生素的作用靶位,該類抗生素通過與16S rRNA的A位點結合而阻礙原核翻譯.但由質粒介導的16S rRNA甲基化酶能將16S rRNA甲基化,從而導致細菌產生對該類抗生素較高的抗性.

㈡ 為什麼轉座子測序可以測定固有耐葯基因

腸球菌由於其細胞壁堅厚，對許多抗生素表現為固有耐葯。其耐葯性包括固有耐葯、獲得性耐葯及耐受性3種。腸球菌對青黴素敏感性較差，對頭孢菌素類耐葯。腸球菌對青黴素耐葯的主要機制為細菌產生一種特殊的青黴素結合蛋白（PBP5），後者與青黴素的親和力減低，從而導致耐葯。此種耐葯以屎腸球菌多見。青黴素不能致腸球菌自溶，因此對腸球菌而言，青黴素為抑菌作用，而非殺菌作用。少數情況下，細菌產生大量青黴素酶而引起耐葯，但通常用頭孢硝噻吩（Nitrocefin）紙片不易獲陽性結果，因此其確切發生率可能被低估。腸球菌對氨基糖苷類的耐葯性有2種：①中度耐葯性（MIC62～500mg/L），系細胞壁滲透障礙所致，此種耐葯菌對青黴素或糖肽類與氨基糖苷類合用敏感；②高度耐葯性（慶大黴素MIC≥500mg/L、鏈黴素≥2000mg/L），系細菌產生質粒介導的氨基糖苷類鈍化酶APH（2」）-AAC（6」）所致，此種耐葯使青黴素或糖肽類與氨基糖苷類的協同作用消失。因此測定氨基糖苷類的耐葯程度，對於臨床治療有重要參考意義。雖然體外葯敏顯示腸球菌對磺胺甲惡唑-甲氧苄啶敏感，但由於體內腸球菌可利用外源葉酸，故使該葯失去抗菌作用。腸球菌對萬古黴素的耐葯性有3種：①VanA型，對萬古黴素、壁黴素均高度耐葯，由位於Tn1546轉座子上的VanA基因編碼；②VanB型，對萬古黴素呈不同程度耐葯，MIC4～1024mg/L，對壁霉 素敏感，由位於染色體上的VanB基因編碼；③Van型，由位於染色體上的VanC基因編碼，本型少見且無臨床意義。

㈢ 質粒擴增不出來是什麼原因（質粒，抗生素，菌落

質粒和PCR產物需要拿去測序有2個目的，一是驗證插入序列的DNA序列是否無誤。第二是看插入的方向和位置是否正確。如果做定量PCR用到質粒的話，一般是用來做標准曲線的。聚合酶鏈式反應是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是「微量證據」的威力之所在。由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。到如今2013年，PCR已發展到第三代技術。1973 年，台籍科學家錢嘉韻，發現了穩定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。 PCR(聚合酶鏈式反應）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

㈣ 高通量測序可以知道某一菌群的豐度嗎

高通量測序技術在腸道菌群多樣性研究中的應用
在人體腸道中生活著數以萬億的共生菌群，它們的種類繁多，可達上千種，數量也很驚人，是人體細胞總量的10倍以上，迄今為止，仍有80%以上的微生物不為人知。這些腸道微生物和人體存在著互利共生的關系，對於維持人類的健康發揮著重要的作用。它們在腸道中保持著一種動態的平衡，能夠合成維生素、幫助人體從食物中吸收營養、維持腸道免疫系統功能、抵擋有害微生物的侵害，但是當這種平衡因某些因素被打破致使腸道菌群發生紊亂時，人體就可能患上諸如肥胖症、糖尿病、腸炎甚至癌症等疾病。為了加深對人類疾病發生原因、葯物作用機理的理解，繼人類基因組計劃之後，科學家們又啟動了人類元基因組計劃，這使腸道菌群的研究迎來了一個新的浪潮。
在以往的腸道微生物群落多樣性研究中，人們主要採用DGGE等分子生物學方法及生物晶元對腸道菌群進行研究，但是這些方法都存在一定的缺陷。如DGGE只能檢測到環境樣品中十幾種優勢菌，但是對痕量微生物卻束手無策；電泳條帶中包含不只一種16S rDNA序列，要獲悉具體的菌種信息，還需進行克隆、測序，實驗操作繁瑣；此外，採用這種方法不能反映微生物的豐度情況。而生物晶元通過固定在晶元上的探針來獲得微生物多樣性的信息，「只能驗證已知，卻無法探索未知」，通過信號強弱判斷微生物的豐度也不是非常的准確。新一代高通量測序技術自2005年問世以來，以其數字化信號、高數據通量、高測序深度、高准確率等特點，已被廣泛的應用於腸道菌群的研究中，發表的論文達60多篇，其中不乏發表於Nature、PNAS、Genome Res、Gut、Gastroenterology等國際頂尖雜志上的文章。Roche 454測序平台由於讀長較長，達300～500bp，能跨越16S rDNA序列一個或幾個可變區，是微生物多樣性研究的最佳平台，使用該平台發表的關於腸道菌群的論文達50多篇。美吉生物擁有Roche 454測序平台，在腸道微生物群落多樣性研究方面積累了大量的成功案例。
美吉生物研究人員通過大量相關文獻的閱讀，發現高通量測序技術在腸道菌群多樣性研究中的應用主要聚焦於以下幾個方面：① 飲食、能量攝取、肥胖與腸道菌群之間的關系；② 腸道菌群與疾病發生之間的關聯；③ 抗生素治療對腸道菌群的影響；④ 不同個體腸道微生物群落結構及其受其他外界因素（壓力、致病菌感染、手術）的影響等。下文對其中的一些文章進行了介紹：
一、飲食、能量攝取、肥胖與腸道菌群之間的關系
1. A core gut microbiome in obese and lean twins--2009《Nature》
Turnbaugh PJ等人對胖瘦不同的同卵雙胞胎（31對）、異卵雙胞胎（23對）及其母親（46個）共154個個體的腸道微生物進行了研究。採用454高通量測序平台測定了這些個體中微生物16S rRNA基因的V2和V6區，並選取了18個個體，測定了其腸道微生物群落的DNA。結果表明肥胖與腸道門級微生物的變化相關，胖人與瘦人相比，微生物多樣性明顯降低，擬桿菌門（Bacteroidetes）所佔比例較低而放線菌門（Actinobacteria）所佔比例較高。Shotgun reads與多個數據進行比對，發現不同個體中含有大量共有的微生物基因，在基因水平上可將它們定義為「核心微生物組」，而個體中的微生物與核心微生物組的偏離，則與各種不同的生理狀態相關（如胖瘦）。
2. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa--2010《PNAS》
為了研究飲食對腸道微生物群落多樣性的影響，Filippo CD等人採用454高通量測序技術比較了15個健康歐洲孩子（EU）及14個健康非洲農村孩子（BF）腸道微生物群落的組成。EU的飲食具有典型的西方特色，而BF的食物則能代表傳統的非洲鄉下的飲食構成。研究人員通過PCR擴增29個糞便樣品的16S rRNA基因V5-V6區DNA片段並進行高通量測序，共獲得了438,219條高質量的reads。RDP資料庫比對結果顯示94.2%的reads屬於放線菌門（Actinobacteria），擬桿菌門（Bacteroidetes），壁厚菌門（Firmicutes）和變形桿菌門（Proteobacteria），然而它們在EU和BF中的比例具有顯著差異。BF腸道中擬桿菌佔大部分，而壁厚菌所佔比例較低。有趣的是，含有大量纖維素和木聚糖水解基因的Prevotella和Xylanibacter菌株只存在於BF中，並且所佔比例較高。

㈤ 16srRNA的測序結果怎麼分析啊謝謝！！！！！

原核生物的30S核糖體亞基中含有16S rRNA.16S rRNA的相對分子質量約為0.6 MDa,長度約為1540 nt.在30S核糖體亞基組裝過程中,16S rRNA與其核糖體蛋白質S4、S7、S8、S15、S17和S20結合先行成初級復合物.
16S rRNA約有一半的核苷酸形成鏈內鹼基對,使其具有約60個螺旋；分子中未配對部分則形成突環.在濃度足夠的Mg2+存在下分離得到的16S rRNA處於緊密狀態,與30S核糖體亞基的結構相似.已發現16S rRNA中的一些序列與蛋白質合成時30S核糖體亞基、mRNA及一些翻譯因子的結合有關.核糖體16S rRNA的3'端能識別待翻譯mRNA的5'端的夏因-達爾加諾序列,起始翻譯.另有研究表明,16S rRNA也能與進入核糖體P位點的tRNA相互作用.
16S rRNA作為研究分類學和系統進化的分子受到很大重視,16S rRNA序列分析是當前對細菌進行分類學研究中較精確的一種技術.隨著分子生物學的快速發展以及該技術在醫學微生物研究中的應用,對16S rRNA作為微生物分類依據的研究也逐漸發展起來並已得到廣泛認同.
位於原核生物70S核糖體A位點的16S rRNA部分的是氨基糖苷類抗生素的作用靶位,該類抗生素通過與16S rRNA的A位點結合而阻礙原核翻譯.但由質粒介導的16S rRNA甲基化酶能將16S rRNA甲基化,從而導致細菌產生對該類抗生素較高的抗葯性.

㈥ 請問，衛生部是否公布了抗生素DDD值的概念和計算方法

DDD值是每日限定一種抗生素必須使用在某個值。衛生部專門有一個表單。網路文庫上就有，搜一下就行。還有相關的ddd演算法。

㈦ 基因克隆的基本步驟有哪些

基因克隆的基本步驟流程如下：

一、目的DNA片段的獲得：

DNA克隆的第一步是獲得包含目的基因在內的一群DNA分子，這些DNA分子或來自於目的生物基因組DNA或來自目的細胞mRNA逆轉錄合成的雙鏈 cDNA分子。

由於基因組DNA較大，不利於克隆，因此有必要將其處理成適合克隆的DNA小片段，常用的方法有機械切割和核酸限制性內切酶消化。若是基因序列已知而且比較小就可用人工化學直接合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據已知序列設計引物，從基因組DNA 或cDNA中通過PCR技術可以獲得目的基因。

二、載體的選擇：

基因克隆常用的載體有：質粒載體、噬菌體載體、柯斯質粒載體、單鏈DNA噬菌體載體、噬粒載體及酵母人工染色體等。從總體上講，根據載體的使用目的，載體可以分為克隆載體、表達載體、測序載體、穿梭載體等。

三、體外重組：

體外重組即體外將目的片斷和載體分子連接的過程。大多數核酸限制性內切酶能夠切割DNA分子形成有黏性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當載體的多克隆位點便可獲得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通過T4 DNA連接酶的作用便可形成重組體，此為黏末端連接。

當目的DNA片斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連接，但連接效率比黏端相連差些。有時為了不同的克隆目的，如將平端DNA分子插入到帶有黏末端的表達載體實現表達時，則要將平端DNA分子通過一些修飾；

如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，PCR法引入酶切位點等，可以獲得相應的黏末端，然後進行連接，此為修飾黏末端連接。

四、導入受體細胞：

載體DNA分子上具有能被原核宿主細胞識別的復制起始位點，因此可以在原核細胞如大腸桿菌中復制，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增，最終獲得大量同一的重組DNA分子。

五、重組子的篩選：

從不同的重組DNA分子獲得的轉化子中鑒定出含有目的基因的轉化子即陽性克隆的過程就是篩選。發展起來的成熟篩選方法如下：

（1）插入失活法：外源DNA片段插入到位於篩選標記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點後，會造成標記基因失活，表現出轉化子相應的抗生素抗性消失或轉化子顏色改變，通過這些可以初步鑒定出轉化子是重組子或非重組子。常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法（白色菌落是重組質粒）。

（2）PCR篩選和限制酶酶切法：提取轉化子中的重組DNA分子作模板，根據目的基因已知的兩端序列設計特異引物，通過PCR技術篩選陽性克隆。PCR法篩選出的陽性克隆，用限制性內切酶酶切法進一步鑒定插入片段的大小。

（3）核酸分子雜交法：制備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。

（4）免疫學篩選法：獲得目的基因表達的蛋白抗體，就可以採用免疫學篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達蛋白抗體，也可從目的基因部分ORF片段克隆在表達載體中獲得表達蛋白的抗體。

(7)抗生素測序演算法擴展閱讀：

基因克隆的注意事項：

1、平端連接：DNA連接酶可催化相同和不同限制性核酸內切酶切割的平端之間的連接。原則上講，限制酶切割DNA後產生的平端也屬配伍末端，可彼此相互連接；若產生的粘性末端經特殊酶處理，使單鏈突出處被補齊或削平，變為平端，也可實行平端連接。

2、加尾連接：同聚物加尾連接是利用同聚物序列，如多聚A與多聚T之間的退火作用完成連接。在末端轉移酶作用下，在DNA片段端製造出粘性末端，而後進行粘性末端連接。這是一種人工提高連接效率的方法，也屬於粘性末端連接的一種特殊形式。

3、人工接頭連接：對平端DNA片段或載體DNA，可在連接前將磷酸化的接頭(linker)或適當分子連到平端，使產生新的限制性內切酶位點。再用識別新位點的限制性內切酶切除接頭的遠端，產生粘性末端。

㈧ 基因原核表達的詳細過程

構建人resistin基因原核表達載體並觀察其表達，為開展對resistin的研究打下實驗基礎。【方法】 酚氯仿一步法從一位2型糖尿病合並膽管癌患者腹壁皮下脂肪組織抽取總RNA，RT-PCR法擴增出resistin基因cDNA，經測序後，PCR產物亞克隆入T載體，用EcoRI和KpnI分別酶切重組T質粒和原核表達載體pGENKS，然後resistin基因片段和表達載體通過T4DNA連接酶進行定向連接，用核酸內切酶EcoRI、KpnI酶切和測序方法鑒定出重組表達質粒。重組表達質粒轉化大腸桿菌JM109,經1mmlo/L IPTG在32℃誘導表達2h，裂解細菌，進行PAGE凝膠電泳鑒定融合蛋白的表達。【結果】RT-PCR擴增產物分子大小為327bp，序列分析表明為人resistin基因完整編碼區。PCR產物與T載體連接、轉化大腸桿菌後，從細菌質粒中酶切回收了目的片段。重組表達質粒經EcoRI和KpnI雙酶切後能產生出327bp、4980bp大小的兩個片段，序列分析表明重組表達質粒包含人resistin基因完整編碼區，基因編碼無移位，PAGE凝膠電泳表明在細菌裂解上清有分子質量為39.5kD的融合蛋白。【結論】 成功構建了人resistin基因原核表達載體，且構建的載體能表達出含目的蛋白的融合蛋白，為下一步研究打下了實驗基礎。

第一節 MRNA
一、 原核生物MRNA的結構
二、 真核生物MRNA的結構
第二節 遺傳密碼
一、 遺傳密碼的破譯
二、 遺傳密碼的特點
第三節 核糖體
一、 核糖體的結構與組成
二、 RRNA與核糖體蛋白的結構與功能
(一)、 rRNA的結構與功能
(二)、 核糖體蛋白的結構與功能
第四節 蛋白質合成的機理
一、 氨醯TRNA合成酶：氨基酸的活化和氨醯TRNA的合成
(一)、 活化
(二)、 連接
二、 蛋白質合成的一般過程
(一)、 翻譯起始
(二)、 延伸
(三)、 終止
(四)、 翻譯後加工
三、 原核生物的蛋白質合成
(一)、 翻譯起始
(二)、 延伸
1、 新氨醯tRNA入位
2、 肽鍵形成（轉肽）
3、 核糖體移位。
(三)、 終止
(四)、 原核生物的翻譯後加工
1、 切除加工
2、 糖基化
3、 甲基化
4、 磷酸化
(五)、 原核生物的翻譯調控
四、 真核生物的蛋白質合成
(一)、 翻譯起始
(二)、 延伸
1、 入位
2、 肽鍵形成（轉肽）
3、 移位
(三)、 終止
(四)、 真核生物的翻譯後加工
1、 切除加工
2、 糖基化
3、 羥基化
4、 磷酸化
5、 親脂修飾
6、 甲基化
7、 二硫鍵形成
(五)、 真核生物的翻譯調控
1、 mRNA向細胞質的運輸
2、 mRNA的穩定性
3、 翻譯的負調控
4、 起始因子磷酸化。
5、 translational frameshifting
五、 蛋白質合成後的定向轉運
(一)、 信號肽: 翻譯轉運同步機制
(二)、 翻譯後轉運機制（posttranslational translocation）
六、 蛋白質的折疊

對於終產物為RNA的基因，只要進行轉錄及轉錄後的處理，就完成了基因表達的全過程。而對於終產物是蛋白質的基因，還必須將mRNA翻譯成蛋白質。
因此，蛋白質是基因表達的最終產物（基因表達的最終產物還包括tRNA、rRNA及其他RNA），蛋白質的生物合成過程實質上也是基因表達的一個過程，它包括轉錄和翻譯。從化學的角度講，蛋白質的合成就是20種基酸按照特定地順序聚合成多肽並按照一定的折疊機制折疊成最終的活性構象狀態。那麼，我們要問，在生物體內是誰直接決定著蛋白質合成的氨基酸順序從而最終主宰了它的高級結構和功能的呢？mRNA。
根據中心法則，DNA特定的鹼基次序A、T、G、C就象一串密碼（稱為遺傳密碼），首先經過轉錄作用，DNA的A、T、G、C鹼基序列嚴格按照鹼基配對原則被復製成mRNA的A、U、G、C序列，於是mRNA就直接充當了蛋白質合成的模板，mRNA的A、U、G、C序列被轉變成蛋白質的氨基酸序列，這種轉變是一個質的飛躍，稱為翻譯，就好象把一種語言（鹼基序列）翻譯成另一種語言（氨基酸序列）。
那麼在翻譯過程中就有兩個關鍵性地問題：（1）遺傳密碼（鹼基序列）到底是怎樣決定氨基酸序列的呢？也就是說什麼樣的鹼基序列決定什麼樣的氨基酸序列呢？（2）通過什麼樣的方式或機制實現鹼基序列到氨基酸序列的轉變？因為氨基酸不能與鹼基配對，因此一個鹼基序列顯然不能象轉錄一樣簡單地直接轉換成氨基酸序列，而必須通過一種中間分子（又稱接頭分子）的媒介作用來實現，而且這種接頭分子要能同時識別鹼基序列和它所決定的氨基酸序列。這種接頭就是tRNA分子。
需要指出的是蛋白質的合成是一個復雜的過程，包括翻譯、翻譯後加工和定向輸送以及正確折疊，而且到現在為止，其中的許多重要方面仍在研究之中。
真核生物蛋白質的合成，需要300多種生物大分子協同工作：核糖體RNA及結合蛋白、各種酶、各種tRNA、加工修飾酶等。
蛋白質合成的場所：標記各種a.a，注入大鼠體內，在不同時間取出肝臟，勻漿，離心分離各種亞細胞器，分析放射性蛋白的分布，證實蛋白質的合成是在核糖體上進行的。
首先認識一下mRNA、遺傳密碼、和核糖體，然後再深入學習蛋白質合成的細節過程。
第一節 mRNA
mRNA的概念首先是由F.Jacob和J.Monod1965年提出來的．因為當時已經知道編碼蛋白質的遺傳信息載體DNA是在細胞核中，而蛋白質的合成是在細胞質中，於是就推測，應該有一種中間信使在細胞核中合成後攜帶上遺傳信息進入細胞質中指導蛋白質的合成，後來經過眾多科學家的實驗，發現了除rRNA和tRNA之外的第三種RNA,它起著這種遺傳信息傳送的功能, 稱為信使RNA(mRNA)。mRNA的半衰期很短,很不穩定,一旦完成其使命後很快就被水解掉。
原核生物和真核生物mRNA的結構差異教大，尤其是在5』端。
一、 原核生物mRNA的結構

（1） 5』端SD序列
P404-P405
在起始密碼子AUG上游9-13個核苷酸處，有一段可與核糖體16S rRNA配對結合的、富含嘌呤的3-9個核苷酸的共同序列，一般為AGGA，此序列稱SD序列。它與核糖體小亞基內16S rRNA的3』端一段富含嘧啶的序列 GAUCACCUCCUUA-OH（暫稱反SD序列）互補，形成氫鍵。使得結合於30S亞基上的起始tRNA能正確地定位於mRNA的起始密碼子AUG。
（2） 原核mRNA分子，許多是多順反子。
轉譯時，各個基因都有自己的SD序列、起始密碼子、終止密碼子，分別控制其合成的起始與終止，也就是說，每個基因的翻譯都是相對獨立的。如E.coli，一個7000b的mRNA編碼5種與Trp合成有關的酶
二、 真核生物mRNA的結構
（1） 真核生物mRNA5』端均具有m7GpppN帽子結構，無SD序列。
帽子結構具有增強翻譯效率的作用。若起始AUG與帽子結構間的距離太近（小於12個核苷酸），就不能有效利用這個AUG，會從下游適當的AUG起始翻譯。當距離在17-80個核苷酸之間時，離體翻譯效率與距離成正比。
（2） 真核生物mRNA通常是單順反子。
真核mRNA具有「第一AUG規律」，即當5』端具有數個AUG時，其中只有一個AUG為主要開放閱讀框架的翻譯起點。起始AUG具有二個特點：
（1）AUG上游的 -3經常是嘌呤，尤其是A。
（2）緊跟AUG的 +4常常是G。
起始AUG鄰近序列中，以ANNAUGGN的頻率最高。若-3不是A，則+4必須是G。無此規律的AUG，則無起始功能。
有關mRNA發現及其證實的細節看書P391.
第二節 遺傳密碼
我們已經知道,多肽上氨基酸的排列次序最終是由DNA上核苷酸的排列次序決定的，而直接決定多肽上氨基酸次序的是mRNA上的核苷酸的排列次序,不論是DNA還是mRNA都是由4種核苷酸構成，而組成多肽的氨基酸有20種,顯然,必須是幾個核苷酸的組合編碼一個氨基酸才能應付局面.用數學方法很容易算出,如果每2個核苷酸編碼1個氨基酸,那麼4種核苷酸只有16中編碼方式，顯然不行,如果每3個核苷酸編碼1個氨基酸,則有64種編碼方式,很理想,如果4對1則有256種,太沒必要也太復雜了,時刻記住生物體是一個最理想的體系.而且科學家們用生物化學實驗已經證實是3個鹼基編碼1個氨基酸,稱為三聯體密碼或密碼子。那麼讓我們看一下遺傳密碼是如何破譯的。
一、 遺傳密碼的破譯
在遺傳密碼的破譯中,美國科學家M.W.Nirenberg等人做出了重要貢獻 ,並於1968年獲得了諾貝爾生理醫學獎.
早在1961年，M.W.Nirenberg等人在大腸桿菌的無細胞體系中外加poly(U)模板、20種標記的氨基酸，經保溫後得到了多聚phe-phe-phe，於是推測UUU編碼phe。利用同樣的方法得到CCC編碼pro，GGG編碼gly，AAA編碼lys。
如果利用poly（UC），則得到多聚Ser-Leu-Ser-Leu，推測UCU編碼Ser，CUC編碼Leu，因為poly（UC）有兩種讀碼方式：UCU——CUC和CUC——UCU
採用這種方式，到1965年就全部破譯了64組密碼子，見表P394。
二、 遺傳密碼的特點
在64個密碼子中有61個編碼氨基酸，3個不編碼任何氨基酸而起肽鏈合成的終止作用，稱為終止密碼子，它們是UAG、UAA、UGA，密碼子AUG（編碼Met）又稱起始密碼子。
密碼子：mRNA上由三個相鄰的核苷酸組成一個密碼子，代表肽鏈合成中的某種氨基酸或合成的起始與終止信號。
（1）方向性：從mRNA的5』到3』
（2）連讀性
編碼一個肽鏈的所有密碼子是一個接著一個地線形排列，密碼子之間既不重疊也不間隔，從起始密碼子到終止密碼子構成一個完整的讀碼框架（不包括終止子），又稱開放閱讀框架（ORF）。那麼如果在閱讀框中插入或刪除一個鹼基就會使其後的讀碼發生移位性錯誤（稱為移碼）。
需要指出的是，兩個基因之間或兩個ORF之間可能會互相部分重疊（共用部分序列）。
（3）簡並性
幾種密碼子編碼一種氨基酸的現象稱為密碼子的簡並性。如GGN（GGA、GGU、GGG、GGC）都編碼Gly，那麼這4種密碼子就稱為Gly的簡並密碼。只有Met和Trp沒有簡並密碼。一般情況下密碼子的簡並性只涉及第三位鹼基。
 問題：簡並性的生物學意義？
A、可以降低由於遺傳密碼突變造成的災難性後果
試想，如果每種氨基酸只有一個密碼子，那麼剩下的44個密碼子都了終止子，如果一旦哪個氨基酸的密碼子發生了單鹼基的點突變，那麼極有可能造成肽鏈合成的過早終止。如GUU編碼Ala，由於簡並性的存在，不論第三位的U變成什麼，都仍然編碼Ala
B、可以使 DNA上的鹼基組成有較達的變化餘地，而仍然保持多肽上氨基酸序列不變（意思基本同上）。
（4）搖擺性
密碼子中第三位鹼基與反密碼子第一位鹼基的配對有時不一定完全遵循A-U、G-C的原則，也就是說密碼子的鹼基配對只有第一、二位是嚴謹的，第三位嚴謹度低，Crick把這種情況稱為搖擺性，有人也稱擺動配對或不穩定配對。顯然，密碼子的第三位和反密碼子的第一位是搖擺位點。
具體說來，反密碼子第一位的G可以與密碼子第三位的C、U配對，U可以與A、G配對，另外反密碼子中還經常出現罕見的I，可以和密碼子的U、C、A配對，這使得該類反密碼子的閱讀能力更強。見表P396
 問題：細胞內有幾種tRNA？
當遺傳密碼破譯後，由於有61個密碼子編碼氨基酸，於是人們預測細胞內有61種，但事實上絕大多數細胞內只有50種左右，Crick也正是在這種情況下提出了搖擺假說並合理解釋了這種情況。
根據搖擺性和61個密碼子，經過仔細計算，要翻譯61個密碼子至少需要31種tRNA，外加1個起始tRNA，共需32種。但是，在葉綠體和線粒體內，由於基因組很小用到的密碼子少，那麼，葉綠體內就有30種左右tRNAs，線粒體只有24種。
（5）通用性：密碼子在不同物種間幾乎是完全通用的。
目前只發現線粒體和葉綠體內有列外情況，這也是如火如荼的轉基因的前提。但要注意的是不同生物往往偏愛某一種密碼子。
第三節 核糖體
核糖體又稱核蛋白體，它是蛋白質合成的場所：標記各種a.a，注入大鼠體內，在不同時間取出肝臟，勻漿，離心分離各種亞細胞器，分析放射性蛋白的分布，證實蛋白質的合成是在核糖體上進行的。對於真核細胞來說，核糖體按其在細胞質中的位置分為游離核糖體（合成細胞質蛋白）和內質網核糖體（合成分泌蛋白和細胞器蛋白）。
不論原核細胞還是真核細胞，一條mRNA可以被同時幾個核糖體閱讀，把同時結合並翻譯同一條mRNA的多個核糖體稱為多核糖體。
一、 核糖體的結構與組成
核糖體是由核糖核酸（稱為核糖體核酸, rRNA）和幾十種蛋白質分子（核糖體蛋白）組成的一個巨大的復合體。不同類型生物中核糖體的結構高度保守，盡管其rRNA和核糖體蛋白的一級結構有所不同，但其三級結構卻驚人的相似。
核糖體的大亞基上有兩個重要的位點：P位點是結合肽醯tRNA的肽醯基的位點，A位點是結合氨醯tRNA的氨醯基的位點。
每個核糖體是由大小兩個亞基組成，每個亞基都有自己不同的rRNA和蛋白質分子，表P307
二、 rRNA與核糖體蛋白的結構與功能
(一)、 rRNA的結構與功能
結構：有大量的莖環（發夾）結構，結構復雜，可能是核糖體的鋼筋骨架。
功能：
（1）蛋白質合成的施工平台（骨架）
（2）催化肽鍵形成的轉移酶活性存在於23SrRNA上
有人小心的去掉細菌核糖體的蛋白質組分，保持rRNA的相對完整性，發現蛋白質的合成仍可進行。
（3）參與tRNA與mRNA的結合
可能的情況是：mRNA先識別rRNA的特定序列並結合固定下來,然後tRNA再識別並固定到rRNA特定的部位，其反密碼子才與mRNA密碼子配對。已經知道16SrRNA上有一段序列與原核mRNA上的SD序列相結合。
（4）在大小亞基的聚合中起重要作用
（5）在翻譯的校正和翻譯的調控方面有重要功能（如可結合調控因子）
總的來說，RNA分子似乎是整個核糖體的活躍的活性中心。
(二)、 核糖體蛋白的結構與功能
結構：大多數核糖體蛋白呈纖維狀（可能起骨架作用），少數呈球狀（可能起生物功能）。
功能：
(1)維持核糖體的結構
(2)新發現：一些核糖體蛋白具有DNA結（Heilix—turn—Heilix模塊）；還有些真核核糖體蛋白具有DNA修復功能
問題：
既然蛋白質是在核糖體中合成的，那麼第一個核糖體中的蛋白組分又是怎樣合成的？第一個核糖體又是怎樣出現的？
先有DNA還是先有蛋白質？
大多數科學家越來越支持RNA起源論，既然核糖體中既有蛋白質又有RNA，那麼徹底搞清楚核糖體的結構與功能及其起源也許會弄清生命的起源和演化。
RNA起源論：
第一個生活細胞里出現的是RNA分子，他同時具有信息儲藏和生物演化的雙重特性，也就是說既可以在一定程度上復制自己，又可以催化一些最初的生化反應，後來，隨著活細胞的進化，DNA逐漸出現並成為更為穩定的遺傳信息儲存分子。
第四節 蛋白質合成的機理
真核生物和原核生物在蛋白質合成方面有許多共同之處，因此，我們先學習蛋白質合成的一般過程，然後分別看一下原核和真核蛋白質合成的具體過程。
游離氨基酸在摻入肽鏈以前必須活化以獲得額外的能量，每一種游離氨基酸首須在專一的氨醯tRNA合成酶的幫助下與專一的tRNA相連（有人稱裝載，LOAD），然後由tRNA負責將它帶到核糖體上的特定位點（A位點上）並添加到正在合成的肽鏈C末端，這種從游離氨基酸到形成氨醯tRNA的過程既是氨基酸的活化過程，也是肽鏈每合成一步或延伸一步的必經准備階段。下邊我們先看一下這個過程是怎樣完成的？
一、 氨醯tRNA合成酶：氨基酸的活化和氨醯tRNA的合成
基酸的活化和氨醯tRNA的合成是蛋白質生物合成的第一步，由氨醯tRNA合成酶催化。氨醯tRNA合成酶既能識別氨基酸，又能識別tRNA。
(一)、 活化
在Mg2+的存在下，氨醯tRNA合成酶首先識別並結合專一的配體氨基酸，然後氨基酸的羧基與細胞環境中的ATP發生反應形成一個酸酐型的高能復合物（氨醯AMP中間復合物）。該中間復合物暫時結合在酶上。

氨基酸 + ATP 氨醯AMP-酶 + PPI
(二)、 連接
由於氨醯tRNA合成酶上還存在專一的tRNA識別位點，因此特定的游離tRNA就會識別並結合到氨醯AMP-酶復合物的活性部位，此時氨基酸就會被轉移到tRNA的3端，其羧基與tRNA 3端的自由-OH形成氨醯酯鍵，從而形成氨醯tRNA，這也是一個高能化合物，其能量足以形成肽鍵。由於氨醯tRNA能量低於氨醯AMP，所以這一過程是可以自發的。

氨醯AMP-酶 氨醯tRNA + AMP + 酶

氨基酸一旦與tRNA形成氨醯tRNA後進一步的去向就由tRNA來決定了，tRNA憑借自身的反密碼子與mRNA上的密碼子相識別，從而把所攜帶的氨基酸送到肽鏈的 一定位置上。每一個密碼子對應的肽鏈位置上都能摻入正確的氨基酸。
結論：
（1）氨基酸的活化和氨醯tRNA的合成是蛋白質生物合成的第一步，每一種氨基酸在被摻入肽鏈之前都首先被活化和連接在專一tRNA上，活化和連接都發生在氨基酸的羧基上。
（2）載體tRNA憑借自身的反密碼子與mRNA上的密碼子相識別而把所攜帶的氨基酸送到肽鏈的一定位置上
（3）遺傳信息是通過mRNA上的密碼子與tRNA上的反密碼子間鹼基配對作用翻譯出來的 。
氨醯tRNA合成酶：
每一種氨基酸都有至少一種專一的氨醯tRNA合成酶，它即能識別氨基酸，又能識別tRNA，從而把特定的氨基酸連到對應的tRNA上，有人也把氨醯tRNA合成酶的雙向識別功能稱為第二遺傳密碼。
不同的氨醯tRNA合成酶在分子量、氨基酸序列、亞基組成上差異較大。它是如何識別氨基酸的呢？仍不甚清楚。一些氨基酸由於結構上的顯著特徵容易識別如大小不同（Trp與Gly），帶正負電荷（lys,asp），而一些氨基酸結構極其相似，如Ile 與Val 僅差一個甲基。盡管如此tRNAIle合成酶也能正確識別，但有時也能錯誤的形成Val –tRNAIle，但是每一種氨醯-tRNA合成酶都有一個校正位點，由於大小原因，只有Val –tRNAIle才能結合到校正位點，然後合成酶將Val又從tRNAIle上將其水解下來。
氨醯-tRNA合成酶還能正確的識別和結合tRNA，對於一些酶來說，tRNA上的反密碼子是其識別特徵，此外，tRNA上的受體莖環（acceptor stem）也是識別特徵。
tRNA分子的突變與校正基因
可以說tRNA是一個萬能接頭：
（1）對氨醯- tRNA合成酶的識別位點（接頭合成酶）
（2）3端-CCA上的氨基酸運載位點（接頭氨基酸，裝載）
（3）對核糖體的識別位點（將氨基酸運送到目的地）
（4）反密碼子位點（接頭MRNA，驗貨並卸載）
同復突變：突變型生物有時重所獲得其原有的性狀，這是通過突變型遺傳物質的化學變化而發生的。這種變化使遺傳物質恢復到有功能的狀態，重所獲得原有的表型，這種過程稱為回復，被回復的生物稱為回復子。
回復突變的原因很多，其中有一種回復突變是由其在基因上發生一個突變引起的，這稱為基因校正突變。大多數較正突變發生在tRNA基因上。
舉例：基因間校正突變
圖
當有某種tRNA突變分子出現時，必定還有可以識別正常密碼子的該種tRNA存在。
二、 蛋白質合成的一般過程
蛋白質合成的一般過程如圖18.3，
可以分為三個階段：起始、延伸、終止，分別由不同的起始因子、延伸因子和終止因子（釋放因子）參與。
(一)、 翻譯起始
（1）小亞基與mRNA結合
（2）起始氨醯tRNA進入P位點，它的反密碼子與mRNA上的起始密碼子AUG鹼基配對。
（3）大亞基與小亞基結合形成起始復合物。
(二)、 延伸
方向：mRNA 5/ 3/
新生肽： N/ C/
（1）就位：第二個氨醯tRNA通過密碼子—反密碼子的配對作用進入核糖體的A位點（氨基位點）。
（2）轉肽：在大亞基上肽醯轉移酶（peptidyl transferase）的作用下，A位點氨基酸的A-氨基親核攻擊P位點氨基酸的羧基基團並形成肽鍵，結果兩個氨基酸均連到了A位點的tRNA上，該過程稱為轉肽作用（transpeptidation），此時，P位點上卸載的tRNA從核糖體上離開。
（3）移位（translocation，也可稱轉位）：核糖體沿著mRNA移動1個密碼子位置，攜帶肽鏈的tRNA轉位到P位點，A位點空出以便接納下一個氨基酸。
(三)、 終止
由於終止密碼子不能結合任何氨醯tRNA，於是肽鏈合成的終止因子（又稱釋放因子）識別並結合到終止密碼子上，接著肽轉移酶的酯化酶功能轉變成水解功能，將肽鏈從P位點tRNA上水解掉，核糖體釋放掉mRNA並解體成大小亞基，翻譯結束。
在翻譯過程中除了核糖體大小亞基、 mRNA和氨醯tRNA外，還需要GTP和許多蛋白輔助因子。這些輔助因子有的起催化作用，有的起改變和穩定構象作用。
(四)、 翻譯後加工
不論原核生物還是真核生物，翻譯完成後，一些肽鏈能直接折疊成最終的活性形式，不需要加工修飾，然而經常的情況是新生肽鏈需要加工修飾（稱為翻譯後加工或修飾）包括：（1）切除部分肽段（蛋白酶）、（2）在特定氨基酸殘基的側鏈上添加一些基團（共價修飾）、（3）插入輔因子，還有些單肽要聚合成多亞基蛋白。
翻譯後加工有兩方面目的：
（1）功能需要
（2）定向轉運的需要（這在真核生物中尤為復雜，合成的蛋白要定向運輸到細胞質、質膜、各種細胞器如葉綠體、線粒體、溶酶體、過氧化物酶體等）。
盡管原核生物與真核生物在蛋白質合成方面有許多相似之處，但也存在差異，這些差異正是一些抗生素治療和研究應用的基礎。見表18.2

表18.2 蛋白質合成的選擇性抗生素抑制劑
抗生素 作用
氯黴素 與50S亞基結合，抑制原核肽轉移酶
cycloheximide 抑制真核肽轉移酶活性
Erythromycin 抑制原核肽鏈延伸
鏈黴素、卡那黴素 結合到原核30S亞基上引起讀媽錯誤，導致合成的多肽連一級結構改變
Tetracycline 與30S亞基結合，干擾氨醯tRNA的結合
三、 原核生物的蛋白質合成
原核生物（大腸桿菌）每秒鍾可翻譯20個氨基酸，比真核生物快得多，而真核生物每分鍾才大約50個氨基酸。
(一)、 翻譯起始
（圖18.5）
翻譯是從形成起始復合物開始的，在原核生物中該過程需要三個起始因子參與：IF1，IF2，和IF3。（IF1的功能尚不清楚）。
（1）IF3首先結合在30S亞基上，防止它過早地與50S亞基結合。
（2）mRNA結合到30S亞基上。
原核mRNA上在距起始密碼子上游約10bp處有一段很短的（約10bp）富含嘌呤的區域稱為SD序列，它能與30S亞基上的16S rRNA 3端的一段互補序列（不妨稱反SD序列）配對結合，mRNA正是通過其SD序列與16S rRNA的配對結合而使它處於核糖體上的恰當的位置，並使起始密碼子AUG處於P位點。SD序列與16S rRNA的配對還為識別起始密碼子和Met密碼子提供了一種機制。
原核多順反子mRNA上的每一個基因都有自己的SD序列、起始密碼子和終止密碼子，每一個基因的翻譯都是相對獨立的。
（3）IF2 、fMet-tRNAfmet結合到30S亞基上
IF2是一個GTP結合蛋白，它先與30S亞基結合並促使起始氨醯tRNA的密碼子與mRNA 上的AUG結合（P位點）。原核生物的起始氨醯tRNA是N—甲醯甲硫氨醯tRNA（fMet-tRNAfmet ）。
（4）50S大亞基結合到30S小亞基上，形成起始復合物。
GTP水解成GDP釋放的能量引起30S亞基構象變化，50S亞基結合到30S亞基上，同時IF2和IF3釋放。
因此，原核生物肽鏈合成的起始復合體由mRNA、70S核糖體、fMet-tRNAfMet組成。
(二)、 延伸
肽鏈延伸分三步進行：（1）新的氨醯tRNA進入核糖體的A位點；（2）肽鍵形成（轉肽）；（3）核糖體移位（轉位）。這三步構成了肽鏈延伸的一個循環。
1、 新氨醯tRNA入位
圖18.6
首先，在進入A位點之前，新氨醯tRNA必須與延伸因子EF—TU—GTP結合。延伸因子EF—TU是一個GTP結合蛋白，參與氨醯RNA的就位。氨醯RNA就位後，EF—TU—GTP水解，EF—TU—GDP從核糖體上釋放下來，在第二個延伸因子EF—Ts幫助下EF—Tu—GDP釋放掉GDP並重新結合一分子GTP再生成EF—Tu—GTP。
2、 肽鍵形成（轉肽）
肽鍵是在肽醯轉移酶催化下形成的，現在認為肽醯轉移酶活性存在於50S亞基23S rRNA上。驅動肽鍵形成的能量由P位點上的氨基酸與它的tRNA的高能肽醯酯鍵提供。新肽鍵形成後P位點卸載的tRNA就離開核糖體。
3、 核糖體移位。
移位需要另一個GTP結合蛋白EF—G（延伸因子G，又叫移位酶）的參與。現在認為，GTP水解成GDP時釋放出的能量促使核糖體構象發生變化，驅動肽醯tRNA從A位點移動到P位點。空下的A位點等待接納下一個氨醯tRNA 。
EF—Tu：機動蛋白（motor protein）
多亞基的復合體（如核糖體）就象一個生化機器。它由幾個相互作用的工作部件組成。機械性的工作是力與距離的產物。每一個生化機器的設計都能非常准確地保證所施用的力的量、所產生運動的量與方向，最後完成一項特定的工作。其中的力通常由核苷酸結合蛋白提供，稱為NTPae，實質上是機動蛋白（motor protein，或稱機械化學轉換器 mechanochemical transcers ）因為NTP（ATP和GTP）的水解所造成的它自身構象的變化驅動了相連分子的構象向所需的方向轉變。這種NTP水解驅動的構象變化主要定位於一個固定化的結構單元（稱為開關）。EF—Tu就是一個廣泛研究的GTP結合機動蛋白。
EF—Tu有三個結構域（ domain），域1含有一個GTP結合位點和二個開關區，域2通過一個柔軟的肽段與域1相連。在結合GTP的活性狀態下（ EF-Tu-GTP），EF-TU有一個aa-tRNA結合位點。aa–tRNA與 EF-Tu-GTP結合後的整個結構稱為三元復合體。
EF-Tu的三個域都參與tRNA的結合。域3的幾個氨基酸殘基與tRNA的TφC環相互作用。aa-tRNA的反密碼子從三元復合物上突出來，以便與mRNA的密碼子相互作用。
在蛋白質合成時，EF-Tu-GDP（非活性狀態）與EF-Ts相互作用釋放出GDP，隨後域1的GTP結合位點結合一分子GTP並改變域1的兩個開關區的構象，結果使域1與域2靠近，形成1個aa－tRNA結合縫（binding cleft）。一旦一個aa–tRNA結合到該裂縫中，?

參考資料：我老師上課的課件。

㈨ 如何從一些有抗生素抗性基因的微生物中篩選出無抗性基因的突變體

這個可以需要做大規模的篩選。
利用無抗性的固體培養基，挑取單克隆，再劃線到有抗性的固體培養基中，沒有生長的就可以提取DNA，送去測序確認了。
望採納，謝謝