rpkm計演算法

A. 基因中map和read是什麼意思

此處，map的意思是「比對到基因圖上」；read是指測序出的一條序列，也稱「讀序」。

正在做RNA seq?

RPKM, Reads Per Kb per Million reads
RPKM=（10的9次方×C）/（N×L）。RPKM為某基因的表達量，C為唯一比對到該基因的reads數，N為唯一比對到參考基因的總reads數，L為該基因編碼區的鹼基數。RPKM法能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響，計算得到的基因表達量可直接用於比較不同樣品間的基因表達差異。

B. 如何根據RPKM值求差異表達基因

差異表達基因分析是根據表型協變數（分類變數）鑒定組間差異表達，它屬於監督性分類的一種。在鑒定差異表達基因以前，一般需要對表達值實施非特異性過濾（在機器學習框架下屬於非監督性分類），因為適當的非特異性過濾可以提高差異表達基因的檢出率、甚至是功效。R分析差異表達基因的library有很多，但目前運用最廣泛的Bioconctor包是limma。

鑒定差異表達基因是表達譜晶元分析pipeline中必須的分析步驟。差異表達基因分析是根據表型協變數（分類變數）鑒定組間差異表達，它屬於監督性分類的一種。在鑒定差異表達基因以前，一般需要對表達值實施非特異性過濾（在機器學習框架下屬於非監督性分類），因為適當的非特異性過濾可以提高差異表達基因的檢出率、甚至是功效。R分析差異表達基因的library有很多，但目前運用最廣泛的Bioconctor包是limma。

C. 拼接轉錄本cluster怎麼確定差異基因

FoldChange，就是兩樣品中同一個基因表達水平的變化倍數。
可以用RPKM、FPKM或TPM值來計算。實驗組和正常組的表達值的差異倍數，是用於檢測差異表達基因的最基本的方法，由於其簡單，易理解和不錯的實驗結果，使得其成為差異表達直觀分析的首要選擇。
FoldChange方法在探測差異表達基因時，能夠直接的得到差異變化值，因此在與差異表達絕對值相關的研究時具有優勢。

D. 為什麼rpkm是fpkm的兩倍

R是reads，F是fragments，因而對於單端測序來說，二者相同；對於雙端測序，FPKM將兩端的reads當作一個fragment，只計算比對到同一轉錄本的數量，所以有RPKM是FPKM兩倍的情況

E. 如何計算cuffdiff中的FPKM值

FPKM與RPKM計算方法基本一致。公式如下：

(5)rpkm計演算法擴展閱讀：

FPKM計算的是片段（fragments），而RPKM計算的是數據（reads）。Fragment比read的含義更廣，因此FPKM包含的意義也更廣，可以是pair-end的一個fragment，也可以是一個read。

比如對應到該基因的read有1000個，總reads個數有100萬，而該基因的外顯子總長為5kb，那麼它的FPKM為：

10^9*1000(reads個數)/10^6(總reads個數)*5000(外顯子長度)=200

或者：1000(reads個數)/1(百萬)*5(K)=200這個值反映基因的表達水平。

F. geo資料庫數據如何標准化

標准化的方法就是Counts值：

對給定的基因組參考區域，計算比對上的read數，又稱為raw count（RC）。

aw count作為原始的read計數矩陣是一個絕對值，而絕對值的特點是基因長度、測序深度不同不可以比較。所以我們要進行標准化把count矩陣轉變為相對值，去除基因長度、測序深度的影響，我們採用分析的。

標准化的三種方法得出的三種值：

RPM (Reads per million mapped reads)：RPM方法：10^6標准化了測序深度的影響，但沒有考慮轉錄本的長度的影響。

RPKM/FPKM方法：

103標准化了基因長度的影響，106標准化了測序深度的影響。TCGA的數據分析多採用這種結果。

TPM (Transcript per million)：TPM的計算方法也同RPKM/FPKM類似，TPM可以看作是RPKM/FPKM值的百分比。

具體判斷方法：

表達量是否需要重新標准化。

可以通過boxplot函數觀察一下樣本表達豐度值的分布是否整齊進行判斷。

是否需要log2:根據數據值的大小。

如果表達豐度的數值在50以內，通常是經過log2轉化的。如果數字在幾百幾千，則是未經轉化的。

G. 差異基因分析pvalue，fdr是怎麼計算的

在利用RNA-seq數據比較分析兩個樣品中同一個基因是否存在差異表達的時候，一般選取兩個標准：
i）FoldChange
FoldChange，很容易理解了。就是兩樣品中同一個基因表達水平的變化倍數。可以用RPKM值來計算，關於RPKM的計算方法，請參考<RPKM的簡介>
ii）FDR校正後的p-value，即q-value
FDR值的計算方法如下：
1）對每個基因進行p-value的計算
假設觀測到基因A對應的reads數為x，已知在一個大文庫中，每個基因的表達量只佔所有基因表達量的一小部分，在這種情況下，p(x)的分布服從泊松分布。已知樣本一中唯一比對到基因組的總reads數為N1，樣本二中唯一比對到基因組的總reads數為N2，樣本一中唯一比對到基因A的總reads數為x，樣本二中唯一比對到基因A的總reads數為y，則基因A在兩樣本中表達量相等的概率可由以下公式計算：

H. fpkm能代表表達量嗎

fpkm不能代表表達量。fpkm是衡量基因相對表達量一個公式。

FPKM是將Map到基因的Fragments數除以Map到Genome的所有Read數(以Million為單位)與RNA的長度(以KB為單位)。適用於單端和雙端測序。

FPKM和RPKM的區別：

不同點就是FPKM計算的是片段（fragments），而RPKM計算的是數據（reads）。

Fragment比read的含義更廣，因此FPKM包含的意義也更廣，可以是pair-end的一個fragment，也可以是一個read。

FPKM和RPKM RPKM代表每千個鹼基的轉錄每百萬映射讀取讀數。 FPKM代表每千個鹼基的轉錄每百萬映射讀取的碎片。

I. 一個基因序號中3T_FPKM是什麼意思

顏色代表了基因在樣品中的表達量水平（log2FPKM+1）。Cuffdiff採用FPKM[16]（）作為衡量轉錄本或基因表達水平的指標，FPKM計算公式如下：